抗P21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞研究中的应用

抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞研究中的应用作者：安政雯1,2；刘宏伟1,3；贾志敏4；李照峰1；StaffanStr觟mblad2；张宏权2(南方医科大学1南方医院口腔科，4药学院，广东广州510515；2KarolinskaInstituteDepartmentofBiosciencesandNutrition,SwedenHuddingeSE-14157；3同济大学附属口腔医学院，上海200072)摘要：目的克隆PAK5-N端基因并诱导其表达，进行多克隆抗体制备，为研究其在牙胚细胞中的生物学功能奠定基础。方法根据人全长PAK5cDNA序列，设计引物；利用PCR技术，以PAK5全长cDNA为模板扩增PAK5-N端基因，将扩增产物克隆至pGEX-4T-1载体中，经EcoRI/XhoI双酶切后进行重组质粒鉴定，DNA测序。以硫代半乳糖苷诱导其在大肠杆菌BL21中表达。利用GST融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化，通过免疫家兔制备多克隆抗体，并在牙胚细胞中进行了初步研究。结果和结论成功克隆了PAK5-N端基因，在E.coli中表达了PAK5-NT，并纯化了GST融合蛋白，制备了PAK5特异性抗体。Westernblotting表明PAK5在牙胚细胞中过度表达，为其在口腔细胞中的生物学功能研究提供了依据。关键词：PAK5；基因克隆；蛋白表达；多克隆抗体；牙胚细胞中图分类号：R392.4文献标识码：A文章编号：1673-4254(2006)06-0730-04Preparationofanti-P21-activatedkinase5polyclonalantibodyanditsapplicationindentalgermcellsANZheng-wen1,2；LIUHong-wei1,3；JIAZhi-min4；LIZhao-feng1；StaffanStr觟mblad2；ZHANGHong-quan2DepartmentofStomatology,NanfangHospital1,CollegeofPharmacy4,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515，China;2KarolinskaInstituteDepartmentofBiosciencesandNutrition,HuddingeSE-14157,Sweden;3AffiliatedDentalSchoolofTongjiUniversity,Shanghai200072,ChinaAbstract:ObjectiveToclonePAK5-NterminalsequenceforexpressioninE.colitoprepareitspolyclonalantibody,andexaminetheroleofPAK5indentalgermcells.MethodsBasedonhumanPAK5cDNAsequence,PCRprimersweredesignedtoamplifyPAK5-Nterminalsequence.ThePCRproductwasclonedintotheexpressionvectorpGEX-4T-1EcoRI/XhoIsites,andtherecombinantplasmidswereidentifiedbyagarosegelelectrophoresisfollowedbyDNAsequenceanalysis.TherecombinantplasmidsweretransformedintoE.coliBL21andtheexpressionofGST-fusionproteinwasinducedbyIPTG.Glutathione-SepharosebeadswereusedtopurifyGST-fusionPAK5-N-terminalfragment.Anti-PAK5polyclonalantibodywasobtainedinimmunizingrabbitswithpurifiedGST-PAK5N-terminalfusionprotein,andtheantibodieswerepurifiedbyproteinAbeadsandusedfordetectionofPAK5expressionindentalgermcells.ResultsandConclusionsWesuccessfullyclonedPAK5-Nterminalgenefragment,andachievedproteinexpression,purificationandproductionofPAK5-NTpolyclonalantibody.TheresultsofWesternblottingindicatedthatPAK5canbehighlyexpressedinthedentalgermcells,suggestingthatPAK5mayplayanimportantroleinbiologicalfunctionofdentalgermcells.Keywords:PAK5-Nterminal;genecloning;proteinexpression;polyclonalantibodies;dentalgermcells收稿日期：2005-09-12基金项目：瑞典医学会(17450)；瑞典癌症基金会(050373)SupportedbySwedishMedicalSociety(17450)andSwedishCancerFoundation(050373)作者简介：安政雯(1973-)，女，在读硕士研究生，主治医师，E-mail:[e-mail]通讯作者：张宏权，电话：[phone]，传真：[phone]，E-mail:[e-mail]；刘宏伟，电话：[phone]，传真：[phone]，E-mail:[e-mail]21激活的磷酸化蛋白激酶(PAKs)作为Rho家族中小GTP酶，Rac和Cdc42下游的效应因子以及MAPK信号通路上游的调控元件，包括2个亚家族(PAKI和PAKII)，6个家族成员(PAK1-6)[1][2]。PAKs在调节细胞生长、增殖、分化、基因调节，细胞骨架重排以及细胞调亡等过程中起到重要作用[3]。PAK5是一种最近被证实而且很少被了解的p21激活的磷酸化蛋白激酶家族成员之一，属于第二组PAK亚家族[4]。研究表明蛋白激酶在口腔细胞中参与重要的功能调节，如参与牙周膜细胞的成骨分化，牙槽骨代谢通路的调节以及在放线伴放线杆菌感染的牙周炎时参与口腔上皮细胞调亡的调控等[5][6][7]。本实验构建了pGEX-4T-1-PAK5-NT表达载体，转化E.coliBL21受体菌，诱导其表达并制备多克隆抗体，初步鉴定了PAK5在牙胚细胞中高表达，为进一步研究PAK5在口腔细胞中的生物学作用提供了重要的研究基础。1材料和方法1.1主要仪器PCR仪(SantaCruzBiotechnology)；凝胶图像分析仪(Bio-RAD)；超声裂解仪(Sonic&MaterialsINC.USA)；高速离心机(KendroLaboratoryProducts.Germany)；超高速离心机(BeckmanCoulter,Inc.)；摇床(KhnerLab-Therm,Switzerland)；Westernblotting转膜仪(Tamromed-lab,UK)。1.2主要试剂DNA纯化回收试剂盒和质粒DNA小量纯化试剂盒(GENOMEDGmbH,Germany)；质粒PCR-Blunt，载体质粒pGEX-4T-1，GlutathioneSepharose4B和层析柱(AmershamBiosciences)；受体菌BL21(Invitrogen)；DAN电泳槽(Bio-RAD)；PVDF膜(MilliporeCorporation,USA)。ECL(PerkinElmerTM)；α-tublin抗体(LabVisionCorporation)；HRP-conj.goatanti-rabbitIgG抗体和HRP-conj.donkeyanti-mouseIgG抗体(Jakson)。1.3方法1.3.1引物根据人类cDNA文库中PAK5全基因组序列，设计扩增N端基因的引物，引物由Invitrogen合成。5'端引物：5'-CCGAATTCATGTTTGGGAAGAAAAAGAA-3'加EcoRI酶切位点。3'端引物：5'-ATCTCGAGTCACGAGGCTCTCTGATACTCC-3'加XhoI酶切位点。1.3.2PCR扩增反应物为：Primer1,Primer2,10×PCRbuffer,25mol/LdNTP,template,Taqpolymersase,dH2O，总反应体积100μl。PCR条件：94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸7min。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收目的DNA片断。1.3.3pGEX-4T-1-PAK5-NT重组质粒载体的构建将目的片断连接入pGEX-4T-1载体后转化E.coliBL21细菌、氨苄青霉素平板筛选、挑选阳性克隆、小量质粒制备及EcoRI/XhoI双酶切获得目的基因，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.3.4序列分析挑选上述阳性克隆，小量提取质粒酶切并测序。测序结果采用NCBI的BLAST软件与数据库中已登陆的序列进行同源性分析，以验证测序结果的正确性。1.3.5PAK5-NT蛋白的表达、纯化及抗体制备pGEX-4T-1-PAK5-NT重组质粒转化E.coliBL21细菌、氨苄青霉素平板筛选、挑选4个阳性克隆分别置与氨苄青霉素终浓度为50mg/ml的LB培养基中，在37℃加入IPTG进行小量诱导。取250μl诱导产物进行SDS-PAGE胶鉴定。然后挑选出表达GST-PAK5-NT的菌株再进行大量诱导。诱导产物分别置与高速离心管中，6500r/min离心20min，收集离心沉淀物经液氮反复冻融，超声裂解及1%TritonX-100处理获取细胞中的蛋白，按GST融合蛋白纯化系统的方案进行蛋白纯化，SDS-PAGE胶进行产物鉴定。将纯化分离出来细胞上清全部在SDS-PAGE胶中进行蛋白分离，切胶回收GST-PAK5-NT特异性的蛋白条带。再将回收胶置于透析袋，加入TAE液，4℃透析过夜后，在DAN电泳槽中50V，电泳6h使蛋白从胶中游离出来进入透析袋的TAE中，收集浓缩含GST-PAK5-NT的TAE液至2ml。分别取浓缩液1μl，2μl与GST标准蛋白在SDS-PAGE胶中进行蛋白定量。当蛋白含量大于1mg/ml时，即可用于抗体制备。本实验抗体由BioGenesGmbH，Germany制备。经免疫2只家兔，20d后第1次放血，2月后二次放血而制备出多克隆抗体。Westernblotting进行抗体鉴定。1.3.6牙胚细胞中PAK5蛋白表达水平的鉴定牙胚细胞裂解液由本室保存，为第3代大鼠牙胚细胞。原代细胞取自出生4d后大鼠的下颌骨第1，2磨牙牙胚。一般认为PAK5在神经细胞中表达高，而在其他组织中表达低。本实验共取4种细胞裂解液蛋白10g与牙胚细胞裂解液一起，利用Westernbloting鉴定，抗体稀释度为1∶1000。2结果2.1PAK5NT基因片断的扩增PAK5NT基因编码序列672bp；PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，可见在700bp附近有一条特异性条带(图1)，与目的基因片断大小相近。图1PCR扩增基因片断鉴定电泳图Fig.1PCRamplificationofthetargetgenefragmentM:DNAmarker;Lanes1-4:Amp