抗原与免疫血清的制备

-1-抗原与免疫血清的制备生态学院生物科学11徐立8号抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。在免疫学实践中，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清或者抗血清。免疫血清的制备是一项常用的免疫学技术，高效价，高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用[1]。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。凝集反应是一种经典的抗原抗体反应，也是高等医学院校学生免疫学实验的重要内容之一，它是指可溶性抗原及其相应抗体在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物的现象[2]。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。前者可利用已知抗血清鉴定未知细菌，优点是极端快速，为诊断肠道传染病时鉴定病人标本中肠道细菌的重要手段；后者是一种定量法，现已发展成微量滴定凝集法，它可利用已知抗原测定人体内抗体的水平(效价)，也是诊断肠道传染病的重要方法。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫（抗体）和细胞免疫（致敏的T淋巴细胞及其产物多种淋巴因子）的过程。这种结合反应的特异性可能是生物学中已知的最特异的反应[3]。1材料与方法1.1实验材料24h培养的大肠杆菌斜面，8~12周龄的健康小鼠，兔子。1.2实验试剂硫柳汞，0.5%石碳酸生理盐水，生理盐水，小鼠红细胞等抗原溶液，HRP-羊抗兔IgG，兔抗鼠IgG，小鼠抗兔IgG抗血清，HRP-兔抗鼠IgG，包被缓冲液，洗涤液，稀释液，底物溶液，2mol/LH2SO4。1.3实验用具McFarland比浊管，乙醇棉花，碘酒棉花，消毒干棉花，灭菌吸管，毛细滴管，小试管，大试管与离心管，1ml注射器(灭菌)，灭菌的离心管、微量滴定板，玻片，微量吸管(20~80µl)，微量吸-2-管的吸嘴，接种环、滴管、湿盒、酶标测定仪等。1.4实验方法1.4.1血细胞抗原的制备采取兔子静脉血0.2ml，用肝素抗凝。低速离心，收集血细胞，用0.9%NaCl调整细胞浓度至4×107个/ml。1.4.2大肠杆菌抗原的制备吸取灭菌的0.5%石碳酸生理盐水5ml，注入大肠杆菌斜面培养物上，将菌苔洗下。用无菌毛细滴管吸取洗下的菌液，注入无菌小试管。将此含有菌液的小试管放60℃的水浴箱中1h，并不时摇动。取一与比浊管同质量的小试管，加菌液1ml，再加石碳酸生理盐水4ml(或更多，视原菌液浓度而定)，混匀后与各比浊管比浊，假若与第3管的浊度相等，则此菌液每毫升的细菌数为：5×900000000=4500000000(45亿)附McFarland比浊管配制法（取同质量同大小的试管10支，按下表加入药品）：试管号123456789101%BaCl0.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01%H2SO49.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0相当每毫升的细菌数3亿6亿9亿12亿15亿18亿21亿24亿27亿30亿用0.5%石碳酸生理盐水将菌液稀释至每毫升含9亿个细菌。将已稀释号的菌悬液接种少量于肉汤培养基中，培养24-28h，观察有无细菌生长，如无细菌生长，即可放冰箱备用。1.4.3免疫小鼠先将此试验所需的试剂准备好。向2只小鼠的腹腔分别注射0.5ml的灭活的大肠杆菌，向另2只小鼠的腹腔内分别注射0.2ml的血清。每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次。1.4.4血清效价测定ELISA法：在酶标滴定板内加0.05ml抗原，置湿盒内4℃过夜，去抗原溶液，用洗涤液重复洗3次，每次3min。然后去洗涤液，加入0.05ml待测样品，置湿盒内，37℃，放置1小时，同时设阴、阳性对照。1小时后用洗涤液重复洗3次，每次3min。然后加入0.05mlHRP-羊抗鼠IgG，置湿盒内，37℃，放置1小时。1小时后用洗涤液重复洗3次，每次3min。然后加入0.05ml新配底物溶液，置湿盒内，37℃，放置30min，然后加入0.05ml终止反应液。观察各孔的颜色，用酶标测定仪测定OD490光吸收值。1.4.5凝集反应-3-玻片凝集法：在玻片的一端加一滴1:10大肠杆菌免疫血清，另一端加一滴生理盐水。用接种环自大肠杆菌琼脂斜面上挑取少许细菌混入生理盐水内，并搅匀；同法挑取少许细菌混入血清内，搅匀。将玻片略为摆动后静置室温中，1～3min后即可观察到一端有凝集反应出现，另一端为生理盐水对照，仍为均匀浑浊。微量滴定凝集法：在微量滴定板上标记10个孔，从1到10。用移液枪于第1孔中加0.08ml生理盐水，其余各加0.05ml。然后加0.02ml大肠杆菌抗血清于第1孔中。然后换一新的枪头，在第1孔中吸上，放下来回3次充分混匀，再吸0.05ml至第2孔。换枪头，同样在第2孔吸上，放下，3次后吸0.05ml至第3孔中，依次类推，一直稀释至第9孔，混匀后弃去0.05ml。每孔加大肠杆菌悬液0.05ml，将滴定板按水平方向摇动，以混合孔中内容物。然后将滴定板置湿盒内，35℃,1小时，再放冰箱过夜。最后观察孔底有无凝集现象。1.4.6制备血清小鼠颈动脉采血，采集的血液移入离心管中，尽量放成最大斜面，凝固后放入4-6℃冰箱中，使其自然析出血清。用已灭菌的毛细滴管洗出血清。若血清中带有红细胞，则用离心沉淀法去掉红细胞。然后将血清分装于灭菌细口瓶中。加入防腐剂，使血清含有0.01%硫柳汞。用蜡或胶带纸封瓶口，贴上标签，注明抗血清名称，凝集效价及日期，放冰箱备用。2结果与分析2.1ELISA法的测定结果在ELISA法的测定结果中，阴性对照孔和阳性对照孔均为无色，试验孔的颜色略显橙黄色。用酶标仪测定OD490光吸收值，结果如下表所示。1-12孔的稀释度分别为：1，1/25，1/50，1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200，1/6400，1/12800，1/25600。根据样品吸光值/阴性对照吸光值2.1为阳性可知，本实验中1、2、3、4、5、6孔为阳性孔，而7-12为阴性孔。因此，该免疫血清的效价为400。表1各加样孔OD值加样孔OD490空白对照孔0.000阳性对照孔0.003阴性对照孔0.0051号孔0.016-4-2号孔0.0153号孔0.0154号孔0.0125号孔0.0126号孔0.0117号孔0.0048号孔0.0049号孔0.00510号孔0.00411号孔0.00412号孔0.0032.2玻片凝集结果表1玻片凝集结果大肠杆菌抗血清+大肠杆菌生理盐水+大肠杆菌画图表示阴性或阳性以（-）或（+）表示+-从以上结果中可以看出，大肠杆菌和大肠杆菌抗血清混合后，出现明显的凝集现象；而大肠杆菌和生理盐水混合，则无凝集现象发生。这说明抗血清具有良好的生物活性和特异性。2.2大肠杆菌抗血清效价测定表2大肠杆菌微量滴定凝集结果管号12345678910血清稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/6401/12801/2560对照结果凝集凝集凝集凝集凝集凝集未凝集未凝集未凝集未凝集效价是指抗血清或抗体仍能产生可观察带的标准免疫反应时的稀释度。从上表可以看出阴性-5-对照未发生凝集现象，小鼠的血清稀释度为1:320时仍能看到凝集反应，稀释度为1:640时就未见凝集反应了，即小鼠免疫血清效价为320。3讨论通过ELISA法测定血清效价是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点。通过使用酶标仪测定OD490光吸收值能够定量和定性地判断免疫血清的是否为阳性。当试验孔和阴性孔的比值大于2.1时，可是认定为是阳性。本次实验得到的结果显示兔抗鼠免疫血清的效价为400。从玻片凝集的结果当中我们可以看到大肠杆菌+大肠杆菌抗血清发生凝集现象，而大肠杆菌+生理盐水，无凝集现象发生。该实验结果为接下来的微量滴定凝集法提供了参考。在使用解剖镜对大肠杆菌微量滴定凝集结果显示当小鼠的血清稀释度大于等于1:320时仍能看到凝集反应，稀释度为1:640时就未见凝集反应了，因此最终确定小鼠免疫血清效价为320。在生产应用上制备抗原须灭活细菌，抗体制备须研究抗原的注射剂量、注射时间和取血时间，避免抗原制备失败或抗体效价不理想。所需细菌样品要求不严格，用离心沉降集菌法或增菌培养均不影响检验的灵敏度和准确性。制备高效价和高特异的抗血清必须有理想的免疫原、适宜的动物和科学的方法，其中抗原纯化是制备特异性抗体的先决条件。本次实验中制备大肠杆菌抗原时使用石炭酸生理盐水和加热60℃1h的目的即是为了灭活，起到纯化抗原作用。抗血清的分离常采用室温自然凝固，然后放置37℃或4℃使血块收缩。前者迅速，但获得血较少；后者时间较长，有时还会出现溶血，但获得血清量多，且效价不会下跌。本实验分离血清时要快速，并且所用器皿要干燥、清洁以防溶血。实验中我们组分离出的血清较其他小组的颜色会有些稍红，究其原因可能是由于器皿不清洁造成溶血。