常用液相色谱柱使用与保养.

常用液相色谱柱使用与保养SOP新药研发部chengrui2011.05主要内容1、液相色谱柱基本理论知识2、常用液相色谱柱使用方法与维护保养3、液相色谱柱常见问题分析与解决方案4、结语1、常用液相色谱柱基本理论知识1.1液相色谱仪与液相色谱柱液相色谱仪由高压液体泵分离系统、检测器及液相色谱柱（含柱温控制系统）等三部分组成。其中液相色谱柱的正确使用，是液相色谱工作的关键，也是采用液相色谱方法获得准确实验数据的必由之路。一套无论多么完美的液相色谱仪，如果得不到优质的色谱柱支持，也只能成为一台液体输送泵而已，毫无价值可言。反之，一根无论多么好的色谱柱，如果得不到完美的液相色谱仪的控制，其作用与价值也会大打折扣。所以，液相色谱仪的性能决定了液相色谱的技术控制性能和数据采集与处理性能；液相色谱柱的性能直接关系到分离分析的准确性与适用性，必须达到很高的性能才能为科学实验提供强有力的数据支持。二者必然相互影响相互促进。1.2液相色谱柱的结构及其主要功能液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。筛板：位于色谱柱两端紧贴柱管端的筛网状薄片，由烧结不锈钢或钛合金制成，孔径取决于填料粒度，一般为0.2~20&um(5~10&um)。用于防止填料从柱管内漏出。接头：柱两端连接流动相与柱管的中空环套，由不锈钢制成。用于柱管路联通与柱端高压固定。封头：柱两端的密封螺丝，用于保存色谱柱时封头。柱填料：装填于柱管内的固定相担体，其直接决定了色谱柱的类型与用途，是色谱柱的核心。多为无定形或球形硅胶基质，也有环糊精、活性炭、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚甲基丙酸酯、氧化铝等基质。用于色谱分离。1.3液相色谱柱的分类与应用范围分类方法很多，可按键合相类型、用途（分析型与制备型）、基质种类等进行分类。1.3.1硅胶基质柱（4大类）目前，分析型液相色谱柱多为硅胶基质柱，细分为：高纯硅胶柱：以高纯度硅烷化硅胶（Silica）为填料，应用范围较广，但只能在PH2.0-7.5，小于60度的条件下使用。又由于强极性硅羟基（Si-OH)的次级保留效应较强，所以应用受到局限，已被键合相柱所取代。反相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合弱极性官能团的固定相。目前多用C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（phenyl，苯基）等。用于分离大多数有机化合物，应用范围最广。正相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合极性官能团的固定相。目前较多的为：NH2—（氨基）、CN—（氰基）、DIOL（二羟基，也常做HILIC单独分类列出，多用于分离有机酸、蛋白质等）。多用于分离光学异构体和反相柱子不能分离的极性比较大的物质。离子交换柱：是以硅烷化硅胶为基质，以磺化交联键合强阳/阴离子基团（磺酸盐/季铵碱）的固定相，又分为强酸性、强碱性、弱酸性、弱碱性等不同规格。用于分离解离性较强的有机盐类化合物。（注意：不要同离子色谱混淆，离子色谱主要是分离无机盐类化合物或某些带点离子。）1.3.2聚合物基质柱聚合物基质柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝胶作为主要填料的一类色谱柱。其相对于硅胶柱具有更强的疏水性及更宽泛的pH范围（1.0～14.0），但柱效较低，目前主要应用于凝胶渗透色谱（GPC）、凝胶过滤色谱（GFC）及分子排阻色谱（MEC）。主要用于分离蛋白质类等大分子化合物。1.3.3其他无机物填料柱这类色谱柱仅限于特殊用途，主要有石墨化碳、氧化铝（Al2O3）、氧化锆（ZrO2）等填料。不需要进行表面改性，其自身表面即可对各类化合物有强保留。可在任意pH（氧化铝除外，不能大于12.0）及高温度（可达100℃）下使用。其中，石墨化碳填料柱能分离多种化合物，主要用于分离几何异构体；氧化铝柱刚性强，柱床稳定，可分离多种化合物且多用于制备色谱；氧化锆柱较氧化铝柱有更强的pH适用范围及能耐受更高的温度，但其应用尚待进一步研究。1.3.4建立色谱柱档案应同色谱仪器档案一样重视色谱柱档案，主要内容包括：品牌、型号、系列号、购进日期、购进发票、使用记录（使用日期、使用人、使用目的、使用情况）、维护保养记录（老化时间、老化人、故障现象、故障原因、处理方法、处理结果及附图）等，并以档案盒形式保存，最好做到专柱专用。1.3.5常用液相色谱柱主要应用范围与特点汇总1.3.5.1反相色谱柱柱填料类型主要应用范围特点C18（ODS）可分离多种化合物，最适合用于极性样品或做离子抑制的样品的分析普适性好；保留性强，用途广；可用于正相。C8（辛基）与C18相似与C18相似，但保留值稍小C3，C4多用于肽类与蛋白质保留值更小C1[三甲基单氯硅烷(TMS)]普通反相溶剂分析疏水性强的化合物；使用高水含量溶剂分析高极性化合物；分离多功能团化合物保留值最小；最不稳定；可用于反相与正相苯基，苯乙基多用于分离分析同时含极性和非极性芳香化合物的混合物保留值适中；选择性有所不同，对极性芳香化合物选择性更强；可用于正相。1.3.5.2正相色谱柱柱填料类型主要应用范围特点CN（氰基）适用于在ODS上无保留或分离时间太长的组分的分离，以及样品中同时含有亲水与疏水性化合物而在ODS上色谱优化困难的场合，也可用于氨基酸分析。属中等级性柱，普适性好；保留适中，可用于正相与反相。NH2（氨基）主要用于分析单糖类、烃类化合物保留性弱；极性大，不稳定，酸性条件下易水解；亦可用于反相。OH（二醇基，DIOL）多用于有机酸、肽类与蛋白质分析极性大于CN，小于NH2，常做HILIC用。可反相用。高纯硅胶柱多用于制备LC，适用于多种化合物普适性好；价廉；操作不太方便；pH窄（2-7.5）；次级保留效应强（硅羟基），易峰拖尾或前延，分叉等。1.3.5.3聚合物基质柱（eg.聚苯乙烯柱）单独的聚苯乙烯类填料柱主要用于分离蛋白质类等大分子化合物，多用于GPC、GFC、MEC等；若与离子交换基团共键则形成离子交换柱，用于分离酸性化合物（磺酸基团）、碱性合物（季铵基团）及药物代谢产物等。特点：在1＜PH＜13的流动相中稳定；分离峰形较好，柱子寿命较长。1.3.5.4其他无机物填料柱如氧化铝、石墨化碳、氧化锆、硅藻土等，主要作制备色谱用。柱填料类型主要应用范围特点Chiral（手性柱）常用于分离手性异构体，根据分离不同机理选择。不同化学性质的异构体需采用不同类型的手性柱。部分亦可用于反相。HILIC（亲水作用柱）最常用Diol柱、丙基酰胺基键合硅胶柱，多用于分析极性化合物、端基异构体、如药物极性代谢产物、多肽、有机酸、糖类等。多用于ELSD检测，C18无保留化合物，毒品检查等。可用于反相。1.4液相色谱柱制备工艺简述不同品牌色谱柱制备工艺各异，但都可归纳为如下流程（以硅胶柱为例）：硅烷化硅胶制备（四乙氧基硅烷脱乙基与聚合）→Si-OH基暴露（脱乙基，置换成H）→海绵状多孔硅胶构造（物理匀质过程）→官能团键合（各种官能团与Si-OH键合）→端基封口（对残余的Si-OH用小分子的氯-甲基、氯-乙基键合）→润湿混合（加乙醇等调匀，其配方各厂家均有专利保护）→装填（机械装填或手工装填，层层装填，压紧，润湿）→高压平衡（轴向加压或径向加压，各厂家均有专利保护）→干燥（此步为关键工艺步骤，各厂家均有专利保护）→削平→组件安装→预平衡→柱效测试流动相平衡→柱效测试→封口→包装1.5液相色谱柱分离机理概述色谱柱类型分离机理备注常规RP柱相似相溶常规NP柱相似相溶离子交换柱样品离子与色谱柱离子达到置换动态平衡要关注pH条件Chiral（手性柱）氢键作用、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用、空间作用一般，AGP、HSA、BSA等以疏水作用、空间作用为主。HILIC（亲水性色谱柱）氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应及相似相溶基于NP原理氨基酸分析柱相似相溶基于RP原理2、常用液相色谱柱使用方法与维护保养(1)认识色谱柱规范化使用与保养的必要性：延长色谱柱使用寿命，降低色谱柱使用成本，逐步提高分析人员色谱柱使用与维护水平，确保试验数据的准确性、可靠性和重现性，提升个人在色谱领域的竞争力。(2)熟悉几个概念：液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板（滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。运载溶剂（ShippingSolvent）：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。保存条件（StorageConditions）：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存温度。保存溶剂（StorageSolvent）：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与比例的溶液。(3)对新柱正确老化处理的必要性认识：新购色谱柱出厂前均采用适合的运载溶剂（ShippingSolvent）饱和，密封，由于运输过程周期较长，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新饱和与老化。若老化方法不正确或时间不够，极易导致色谱柱在使用较短时间后即产生分离度下降、峰形变差、峰拖尾等柱效降低的情况。需根据色谱柱不同类型选择不同饱和与老化方法。2.1普通C8及C18反相色谱柱（C8&C18Reversed-phasechromatographycolumn）（1）准备新鲜超纯水及色谱级乙腈或甲醇，冲洗色谱仪器系统，保证仪器系统管路干净。（新柱老化前，此步决不可忽略）（2）将色谱柱反向连接，不接检测器。用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗20～30min。（目的是冲洗出柱入口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常）（3）再将色谱柱正向连接，不接检测器。用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗20～30min。（目的是冲洗出柱出口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常）（4）连接检测器，开启柱温达30℃～40℃，用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗4h以上。（目的是充饱和色谱柱，去除柱内空气）（5）用水-有机相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速冲洗2h以上[或在120min内以水-有机相（95:5→0:100）梯度变化，以0.3～0.6ml/min流速冲洗]→再用100%有机溶剂，以0.3～0.6ml/min流速冲洗1h以上→最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。（目的是老化色谱柱）（6）在平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右（目的是相平衡过渡）。如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡，必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内析出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。（7）然后更换成新制并经0.45um滤膜过滤，超声脱气后的流动相，按检测方法平衡至少1h，待基线稳定后，开始进样检测。（8）由于是新柱首次使用，在进样完成后需立即对色谱柱进行净化和有机溶剂饱和。方法是：用水-有机相（90：10～95:5），以0.6ml/min流速冲洗1h以上→再用水-有机相（90：10～95:5），以1ml/min流速冲洗30min以上（或者采用溶剂梯度变化至100%有机相冲洗120min以上）→最后用100%有