探索影响过氧化氢酶活性条件的实验设计

第1页探索影响过氧化氢酶活性条件的实验设计安徽省歙县中学高二年级罗琼李岚方声阳徐冉指导教师吴宏昌吴美琴问题由来：2002年10月上旬，在做高中《生物》（必修）第一册实验六《探索淀粉酶对淀粉和蔗糖水解作用》实验时，因没有α－淀粉酶，改用唾液淀粉酶，但取唾液极为繁琐。实验七《探索影响淀粉酶活性的条件》实验，如仍用唾液，唾液量比实验六多1倍，显然行不通，于是老师用新鲜猪肝中的过氧化氢酶替代，结果发现实验中存在着不足，还有许多亟待改正之处。于是萌发了用新鲜猪肝中的过氧化氢酶重新设计实验七的想法。1用新鲜猪肝中的过氧化氢酶替代α－淀粉酶实验设计优点1）材料简单易推广据了解，α－淀粉酶难以购买（黄山市没有），价格较贵，且要新鲜。而大量的唾液淀粉酶也难取，故近两年新教材中的实验七几乎未做（黄山市内）。而猪肝购买和使用方便，价格便宜。2）实验的时间短整个实验约15分钟，比用α－淀粉酶实验少5分钟。3）现象明显易操作过氧化氢在过氧化氢酶的作用下生成水和氧气，氧气易检验和观察。2实验计划①2002年10月上旬，做了高中《生物》第一册实验六和实验七之后，萌发重新设计实验的想法。②自学一些酶和实验设计的有关知识。③2003年元旦放假时，组成实验小组，共同研究，初步确定实验方案。④寒假开始，实验小组分析实验方案，制订实验实施细则，分步实施。⑤2003年春节前，撰写小论文。⑥对论文中的不足之处，在开学前继续实验探讨。3实验原理利用酶专一性：新鲜的猪肝中含有过氧化氢酶能使过氧化氢分解产生水和氧气。4实验材料用具100ml烧杯、天平、研钵、20ml量杯、胶头滴管、纱布、15×150mm试第2页管、温度计、水槽、酒精灯、三角架、石棉网、直尺、火柴、卫生香、玻璃棒、试管夹、恒温箱、电热水壶、电冰箱体积分数为30％的过氧化氢溶液、质量分数为5％的盐酸溶液、质量分数为0.1％的氢氧化钠溶液、水、热水、蒸馏水、冰块、新鲜的猪肝5实验探究过程用新鲜猪肝中的过氧化氢酶替代α－淀粉酶进行实验设计，必须解决的问题：①猪肝研磨液适宜的浓度。②过氧化氢适宜的体积分数。③过氧化氢酶活性最强时的适宜温度和变性失活的最低温度。④过氧化氢酶适宜保温时间。⑤盐酸和氢氧化钠使过氧化氢酶失活适宜时间。只有把上述问题一一用实验确定,才能对高中《生物》（必修）第一册实验七进行修改（主要考虑温度的影响）。实验数据的处理：实验数据的处理主要是H2O2在过氧化氢酶的作用下产生氧气量的确定问题，在实验过程中，用直尺测量氧气气泡在试管中的液面上上升的高度，氧气气泡上升高度与反应强度呈正相关（说明：在做本实验时H2O2和过氧化氢酶反应时试管应轻轻振动摇匀，如振动过大，过快的反应使产生的氧气形成的气泡有大有小无法判断；同时利用了酶的高效性，在极短的时间内反应就完成了）。5.1探索猪肝研磨液适宜浓度的实验1)分别配制质量分数为5%、10%、15%、20%、25%、30%的新鲜猪肝研磨液。2)取3支洁净的试管，分别滴入3滴质量分数5%的新鲜猪肝研磨液。3)用同样的方法，分别取3支洁净的试管，分别滴入3滴质量分数10%、15%、20%、25%、30%的新鲜猪肝研磨液。①将上述试管放在0℃冰水中保温5min，然后取出试管，再加入体积分数为3％的H2O2溶液1mL，轻轻振动后观察现象。现象如表1。第3页表1序号1（5%）2（10%）3（15%）4（20%）5（25%）6（30%）气泡上升平均高度(cm)4.425.675.706.336.677.73卫生香复燃复燃复燃复燃复燃复燃②将上述试管放在30℃水浴中保温5min，然后取出试管，再加入体积分数为3％的H2O2溶液1mL，轻轻振动后观察现象。现象如表2。表2序号1（5%）2（10%）3（15%）4（20%）5（25%）6（30%）气泡上升平均高度(cm)5.576.506.697.177.407.63卫生香复燃复燃复燃复燃复燃复燃③将上述试管放在36.5℃水浴中保温5min，然后取出试管，再加入体积分数为3％的H2O2溶液1mL，轻轻振动后观察现象。现象如表3。表3序号1（5%）2（10%）3（15%）4（20%）5（25%）6（30%）气泡上升平均高度(cm)4.835.337.338.578.638.87卫生香复燃复燃复燃复燃复燃复燃④将上述试管放在67℃水浴中保温5min，然后取出试管，再加入体积分数为3％的H2O2溶液1mL，轻轻振动后观察现象。现象如表4。表4序号1（5%）2（10%）3（15%）4（20%）5（25%）6（30%）气泡无无无无无少量（H2O2自身分解）卫生香不复燃不复燃不复燃不复燃不复燃不复燃猪肝灰白色固体第4页由以上四个实验比较可知，质量分数为15%的猪肝研磨液现象已较明显。故选择质量分数15%的猪肝研磨液进行实验。5.2探索过氧化氢最合适的体积分数1）用体积分数为30%的H2O2分别配制体积分数为0.3%、1%、2%、3%的H2O2溶液。①取3支试管，分别滴入3滴15%的新鲜猪肝研磨液放入35℃温水中保温5min后，分别加入体积分数为0.3%过氧化氢溶液轻轻振动后观察现象。用同样的方法，取3只试管，分别滴入3滴15%的新鲜猪肝研磨液放入35℃温水中保温5min后，分别加入体积分数为1%、2%、3%的H2O22mL，轻轻振动后观察现象（结果见表5）。表5浓度0.3%1%2%3%气泡上升平均高度（cm）0.773.979.33喷出试管（15cm）②用上述同样方法，放入0℃冰水混合物中保温5min后分别加入0.3%、1%、2%、3%的H2O22mL，轻轻振动后观察现象（结果见表6）。表6浓度0.3%1%2%3%气泡上升平均高度（cm）0.402.008.9712.53由以上实验数据可得，1%的过氧化氢实验现象已较明显，所以选择体积分数为1%的过氧化氢。5.3探索过氧化氢酶适宜的保温时间的实验取3支试管，分别滴入3滴15%的猪肝研磨液，放入35℃温水中分别恒温4min。用同样方法各取3只试管，分别滴入3滴15%的猪肝研磨液，放入35℃温水中分别恒温5min、6min、7min、8min，然后加入1%H2O22mL，轻轻振动后观察现象（结果见表7）。表7第5页时间（min）45678气泡上升高度（cm）4.934.835.175.205.47卫生香复燃复燃复燃复燃复燃由以上实验数据可知，6min为适宜保温时间。5.4探索过氧化氢酶活性最强时的适宜温度的实验1）分别取5支试管，分别滴入3滴质量分数为15%的新鲜的猪肝研磨液。⑴将5支试管放入0℃水浴中保温6min，放在水浴中加入体积分数为1％的H2O2溶液，观察现象。⑵用同样的方法分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃水浴中保温6min，再加入体积分数为1％的H2O2溶液，轻轻振动后观察现象（结果见表8）。表8气泡试上升高管度(cm)温度12345平均值（cm）0℃1.72.12.01.81.91.905℃1.62.62.32.73.22.4510℃2.63.52.52.82.42.8015℃3.44.22.33.63.53.4020℃3.84.34.24.04.44.1425℃3.74.54.64.94.34.4030℃5.04.85.25.14.95.0035℃6.54.93.56.55.35.5440℃4.74.55.85.53.64.8245℃4.75.04.82.04.14.1350℃3.12.43.55.13.43.7055℃2.11.52.21.91.31.802）由以上数据画图：第6页1.92.452.83.44.144.455.544.824.133.71.801234560℃5℃10℃15℃20℃25℃30℃35℃40℃45℃50℃55℃由图一可知，35℃为过氧化氢酶活性最强时的温度，而适宜温度为30℃~35℃。5.5探索过氧化氢酶失活变性的最低温度1）取3支试管并滴入3滴质量分数为15%的猪肝研磨液，然后放在50℃水中保温6min。用同样方法，各取3只试管并滴入3滴质量分数为15%的猪肝研磨液在53℃、56℃、59℃、62℃、65℃水中保温6min。2）再向试管中加入体积分数为1%的H2O22mL，轻轻振动后观察现象（结果见表9）。表9温度50℃53℃56℃59℃62℃65℃气泡上升平均高度（cm）4.704.303.102.50无无卫生香复燃复燃复燃复燃不复燃不复燃由上述数据可知，62℃时过氧化氢酶已经失活，故增加实验（结果见表10）。表10温度60℃61℃气泡上升平均高度（cm）0.30无（有少量气泡生成）卫生香不复燃不复燃图一tcm第7页3）增加对比实验：①各取2支试管，分别加入3滴质量分数为15%的新鲜猪肝研磨液和3滴蒸馏水。②放入61℃水浴中保温6min。③分别加入2mL体积分数为1%的过氧化氢溶液，轻轻振动后观察现象（结果见表11）。表11序号气泡卫生香注：此时猪肝颜色为灰白色且为凝固的块状1（蒸馏水）试管壁上有少量不复燃2（猪肝研磨）液）试管壁上有少量不复燃由此可知，有少量气泡是H2O2在61℃时自身分解产生的。过氧化氢酶失活变性的最低温度为61℃。5.6探索质量分数5%的盐酸使过氧化氢酶失活的最适时间1）取5支试管，分别滴入3滴质量分数为15%的猪肝研磨液，在35℃水中保温6min；2）往5支试管中分别加入质量分数5%的盐酸1mL，然后分别维持0s、30s、60s、90s、120s、150s，再加入1%的H2O22mL，轻轻振动后观察现象（结果见表12）。表12时间0s30s60s90s120s150s气泡上升高度（cm）无无无无无无卫生香不复燃不复燃不复燃不复燃不复燃不复燃结论：加入盐酸后立即失活。5.7探索0.1g/mL的氢氧化钠溶液使过氧化氢酶失活的最适时间1）取5支试管，分别滴入3滴质量分数为15%的猪肝研磨液，在35℃水中保温6min；2）往5支试管中分别加入0.1g/mL的NaOH溶液1mL，然后分别维持0s、30s、60s、90s、120s、150s，再加入1%的H2O22mL，轻轻振动后观察现第8页象（结果见表13）。表13时间0s30s60s90s120s150s气泡上升高度（cm）无无无无无无卫生香不复燃不复燃不复燃不复燃不复燃不复燃结论：加入氢氧化钠后立即失活。6分析与讨论6.1用过氧化氢酶代替α－淀粉酶实验，猪肝研磨液质量分数为15%；过氧化氢酶活性最强的温度为35℃，适宜温度为30℃-35℃；变性失活的最低温度为61℃；过氧化氢的质量分数为1%；高浓度的盐酸和氢氧化钠使过氧化氢酶在极短的时间内变性失活。因此高中《生物》第一册实验七设计如下:实验题目：探索影响过氧化氢酶活性的条件目的要求：（1）初步学会探索影响酶活性条件的方法。（2）探索过氧化氢酶在不同温度和PH下催化过氧化氢水解的情况。实验原理：新鲜的肝脏中含有过氧化氢酶，根据酶的专一性，可知其可以催化过氧化氢分解成水和氧。材料用具：质量分数为15%的猪肝研磨液，新配制的体积分数为1%的过氧化氢溶液，质量分数为5%的盐酸，0.1g/mL的氢氧化钠溶液，蒸馏水，冰水，热水；100mL烧杯，15×150mm试管，量筒，滴管，酒精灯，石棉网，火柴，三脚架，温度计，卫生香。方法步骤：一、温度对酶活性的影响（1）取三支洁净的试管，编上号，并且分别滴入3滴新鲜的质量分数为15％的猪肝研磨液。（2）将三支试管分别放入35℃的温水（50mL）、70℃的热水（50mL）、0℃的冰水（50mL）中，维持各自的温度6min（3）在各自的条件下，分别注入2mL体积分数为1%的过氧化氢溶液，轻轻振动。第9页（4）取出试管，观察并记录哪支试管产生的气泡多，将点燃但无火焰的卫生香分别放入三支试管内液面的上方，观察并记录卫生香是否燃烧及燃烧猛烈情况。将结果填入下表：序号1（0℃）2（35℃）3（70℃）气泡多少及上升高度卫生香是否燃烧及燃烧猛烈情况二、PH对酶活性的影响（1）取三支洁净的试管编上号，并且分别滴入3滴新鲜的质量分数为15％的猪肝研磨液