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PCR的一般流程（以TaqDNA聚合酶为例）一、试剂和仪器1、仪器：PCR仪、移液器、离心管和枪头（121℃灭菌20min，烘干）、冰盒、板架、离心机。2.ddH2O：三蒸水121℃灭菌20min，4℃保存；3.Buffer：含Mg2+，10×，-20℃保存；4.dNTP：保存液为25mM，使用前用ddH2O稀释为2.5mM并分装，避免污染，-20℃保存。5.引物：引物干粉在溶解前先12,000rpm离心2min，再用ddH2O溶解至10μM，涡旋震荡使其充分溶解，-20℃保存；6.模板。7.TaqDNA聚合酶：-20℃保存。二、实验准备1.预订PCR仪，填写好使用时间；2.制冰；3.将所需试剂解冻、混匀、瞬离，置于冰上，模板要放在冰上解冻。三、步骤：1.设计实验，认真阅读相关试剂说明书。2.将离心管置于冰上，按照如下体系加入样品。加样顺序为：ddH2O→Buffer/dNTP/引物/模板。TaqDNA聚合酶反应体系（25μL）试剂用量（μL）ddH2O18.375μLBuffer（Mg2+，10×）2.5μLdNTP（2.5mM）2μL引物（正向和反向，10μM）各0.5μL模板DNA102~105copiesTaqDNA聚合酶*0.125μL*注意：加酶之前将酶拿出放冰上，使用完立即放回冰箱。3.在离心管盖上写好每个样品的编号，瞬离。4.设置好PCR程序，待反应温度达到实验需要时，将样品放入PCR仪，尽量放在中央的孔。5.将试剂放回原处，移液器调回最大量程，整理实验台。6.反应结束后，及时停止PCR程序（不要停在4℃太久），取出样品，关好PCR仪。四、其它注意事项：1.正确使用移液器、离心机和PCR仪；2.手或移液器不要接触反应管或试剂瓶、管的内壁、盖内侧；3.不使用枪头时，盖好枪头盒盖；4.枪头只能使用一次；5.合理设计实验，使用适当的阴性对照很重要，如：使用不加DNA的材料进行PCR扩增，以证明缓冲液或其他试剂中是否存在任何可影响PCR的污染物；6.如果一次实验需做多管样品，尽量先配制mix，由于存在液体混合后的体积变化和挂液，计算mix用量要比实际管数多一些；7.反应在PCR仪进行期间，最好能检查一下程序是否在正常运行，及时发现异常。3.2移液器的使用方法1.调节量程：轻轻旋转量程调节圈，注意不要超过量程。建议从高到低调节量程，必要时，可旋转量程调节圈稍超过所需数值，再向回旋转，移液可以更准确。2.装配枪头：轻轻按压，将枪头盒上的枪头装配到移液器。3.吸液：按下操作键至一档（设定体积），将枪头垂直浸入液体约4mm；让操作键慢慢复位，此过程中保持枪头浸入深度，防止吸入空气；将枪头慢慢移出液面，并确保枪头外壁无残留液体。（建议每个新枪头先经过一到三次的吸液和放液来润湿，有助于提高移液准确度。吸取大体积液体时，将枪头保持浸入状态约3秒钟，再移液。）AB图3.2.1移液器的吸液（A）和放液（B）4.放液：将枪头倾斜地紧贴管壁，将操作键慢慢按向一档（设定体积），等待，直到不再有液体流出；将操作键按向二档（吹液），将枪头完全排空；仍然按住操作键，在管壁上擦拭枪头；在管外，慢慢让操作键复位；按下脱卸键卸掉枪头。5.其它注意事项：（1）轻拿轻放，使用后调回最大量程；（2）保持移液器洁净。（3）与水有很大物理性差异的溶液，或在移液器枪头和液体间存在很大温差的溶液，可能会导致移液不准，要注意检查移液体积。3.3PCR反应原理及过程3.3.1反应原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链（图3.3.1）。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。3.5.2反应过程PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成（图3.3.2）：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。图3.3.1PCR反应原理图3.3.2PCR的基本步骤3.4几种常用PCR方法3.4.1标准PCR（StandardPCR）该方法适用于扩增小于3000bp的DNA序列。建议体系：ReactionVolume100μLTaqPolymerase2-2.5UPrimers0.1-1.0μMeachdNTP0.2mMeachSalt6-50mMKClor(NH4)2SO4Mg2+1.5-5.0mMMgCl2orMgSO4BufferTris-HCl10-50mM,pH7.5-9.0Template102-105copies3.4.2长范围PCR（LongandAccuratePCR，LAPCR）使用混合的聚合酶（含有一种能校对的聚合酶）能够增加可扩增产物的大小（5kb~40kb），因为能去掉错误掺入的核苷酸，而不引起链的终止。ReactionVolume33μLPolymeraseKlentaq1(a)plus1/16Pfuor1/50DeepVent(byvolume;1/160or1/500byunits)Salt16mM(NH4)2SO4,noKClMg2+3.5mMMgCl2pH9.2Buffer50mMTrisTemplate2nglambdaDNACycles20ExtensionTemp68℃ExtensionTime11-24min(longeratlatercycles)3.4.3热启动PCR（HotStartPCR）热启动PCR是提高产量和特异性的一种简单方法，但也可能会造成重复性和污染等问题。室温下加样，可能会导致引物和模板的非特异性结合。在PCR的最初几个循环里，通过变性可以防止这些非特异性结合产物的延伸。热启动PCR则通过控制一种PCR成分的加样时间，来提高扩增的特异性。通常，直到反应温度到达引物最适退火温度以上时，再加入这种关键成分，如引物、酶、Mg2+或dNTP。热启动温度随推迟反应的方式而改变。推迟PCR反应有几种方式。最简单的一种是，在反应管达到第一个循环的DNA熔解温度之前，不要将DNA聚合酶加到反应管内。当处理少量样品时，这种方法可以得到令人满意的效果；但当处理大量样品时，则效果不佳。一种更方便的方法是，使一种组分在达到一个适当的温度之前处于无效状态。例如，把聚合酶或镁盐掺入到蜡珠内便可做到这一点，这些珠子在适当的温度熔化，能够使反应开始。另一种方法是，在开始时，用一种抗体与聚合酶形成复合物，使聚合酶灭活，在高温下抗体变性，能够使聚合酶发挥功能。如果在热启动PCR中使用修饰过的酶，则需要向典型的PCR反应中加一预热步骤，预热温度可以在92-100℃之间，时间为2-20分钟，有助于消除在较低温度时引物和模板结合形成的非特异产物。热启动PCR可以与其它PCR方法（如touchdownPCR）结合使用。3.4.4温度递降PCR（TouchdownPCR）TouchdownPCR最初用来简化确定最适退火温度的过程。最初使用一个高的退火温度（在此温度下，即使正确的结合可能也无法进行），在随后几轮，降低退火温度，当降到某一个温度点时，只有正确匹配的引物-模板能够退火，而不正确的匹配则不能够退火，因此DNA合成能够开始。尽管后来的循环可能会在不是最严谨的条件下进行，但早期的循环已在最严谨的条件下进行，想要的目标产物将是最丰富的。通常，第一个循环的退火温度设置为高于理论Tm15℃，在接下来的循环里，每循环降低1-2℃，直到低于Tm5℃左右。3.4.5嵌套PCR（巢式PCR，NestedPCR）在这种PCR中，进行两次连续的PCR。第一次PCR使用常规的模板，然后用第一次PCR反应的产物（通常要稀释适当倍数）作为第二次PCR的模板，将第二次PCR的引物设计成能够与第一次PCR目标产物的序列退火。虽然第一次PCR除了能产生目标产物外，可能还会产生一些非特异性的产物，但非特异性的产物几乎不可能也包含第二次PCR所用引物的两个位点。因此，只有第一次PCR的目标产物才可能是第二次PCR的合适模板。3.5PCR可变因素PCR的各种因素相互影响，相互制约，很难同时提高PCR的特异性、产量和保真度。3.5.1引物（Primers）标准用量：0.1-1.0μM。多数情况下，0.2-0.5μM就能满足需要。提高特异性：1、降低引物和dNTP的浓度可以显著提高特异性。高浓度会导致非特异结合、引物二聚体的形成。2、在适当范围内，降低引物/模板的比例。提高产量：提高引物/模板的比例。如果有过剩的引物，需要降低引物浓度。3.5.2聚合酶（Polymerases）标准用量：1-5Units/μL。（不同供货商对“Unit”的定义会有差别。）提高特异性：在适当范围内，降低聚合酶浓度。聚合酶浓度是决定PCR严格度的一个关键因素。高浓度的聚合酶不仅会降低特异性，还会造成不必要的浪费。提高保真度：使用高保真聚合酶。3.5.3模板（Templates）标准用量：102-105个拷贝。反应中的模板量应当用目的序列的拷贝数来衡量。一般，降低DNA模板浓度，也应该降低聚合酶浓度（在合适范围内）。提高特异性：1、增加模板量。2、降低引物/模板的比例。提高产量：1、增加引物/模板比例。2、扩增较小片段的模板DNA，更易获得较高产量。3.5.4dNTP（DeoxynucleosideTriphosphates）标准用量：20-200μM。四种dNTP的浓度应当相同，并且要高于每种dNTP的估算Km（10μM-15μM）。提高特异性：降低dNTP浓度。需要注意的是，Mg2+的浓度也要等摩尔比例地降低。提高产量：对于较长的模板序列，要适当增加dNTP。提高保真度：降低dNTP浓度。3.5.5镁离子（Magnesiumions）Mg2+浓度应当比总dNTP浓度多0.5-3.0mM。提高特异性：降低浓度。注意如果Mg2+浓度不正确会降低产量。提高产量：提高浓度。然而，Mg2+浓度过高易导致非特异性结合和电泳smear。3.5.6预温育的温度和时间（PreincubationTemperaturesandTimes）标准范围：92-96℃，30sec-10min。预温育能降低样品中有害蛋白酶和核酸酶的活性，还能保证基因组DNA中复杂模板完全变性。3.5.7解链温度和时间（MeltingTemperaturesandTimes）标准范围：68-75℃，30-120sec。通常将加热变性使50%的双链DNA解链的温度称为DNA的解链温度或熔解温度，用Tm表示。影响解链温度的因素是样品的总质量和浓度。有一些方法可以计算解链温度，但只是估计，实验所需的最优温度还需要结合经验来尝试。时间方面则需要考虑PCR仪的升温降温过程，以及PCR仪是根据样品温度来计算时间，还是仅根据仪器孔的温度来计算时间。对于=20bp的引物，Tm=[4℃(G+C)+2℃(A+T)]；对于20bp的引物，Tm=62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length。3.5.8退火（Annealing/Hybridization）标准范围：37-65℃（一般是比Tm低5℃），10-120sec。LAPCR的退火时