摇瓶种子的制备及菌种的保藏2

主题二摇瓶种子的制备及菌种的保藏带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置第三节摇瓶种子的制备将斜面种子或米孢子接种入装在锥形摇瓶(又称三角摇瓶)内的液体营养培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子，就叫做摇瓶种子。摇瓶种子可以在摇瓶中传代，第一代俗称“母瓶”，第二代就叫做“子瓶”。母瓶或子瓶可用于生产上种子罐的接种，也常常作为摇瓶发酵试验的种子。1.摇瓶种子的制备工艺•(1)工艺流程•摇瓶种子的制备流程如图5—l所示。•斜面种子或米孢子•培养基配制分装灭菌接种恒温振荡培养摇瓶种子••图5—1摇瓶种子制备的工艺流程（2）培养基配制摇瓶种子以培养具有强生长活性的营养菌体为目的，因而在配制培养基时必须全面、均衡地满足菌体生长对各种营养物质的要求，包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。摇瓶种子在培养过程中一般不便于调节pH，故在培养基成分的选择时还应考虑培养过程中pH的稳定，可以通过生理酸、碱性物质的平衡搭配及加入磷酸盐、碳酸钙之类缓冲剂来实现。分装培养基的三角摇瓶用棉塞或泡沫塑料塞口，置高压蒸汽锅内灭菌。灭菌结束后要缓慢降压，以免培养基暴沸冲湿塞子。(3)接种摇瓶种子的接种一般采用斜面种子挖块法或米孢子粒计数接人法。这种接种法难于掌握一致的接种量，可能影响摇瓶种子质量的稳定。对接种量敏感的菌种，最好采用悬液接种法，即用无茵蒸馏水将斜面种子或米孢子粒上的细胞或孢子洗下，制成细胞或抱子悬液，然后按一定体积或一定细胞(孢子)数接种至摇瓶种子培养基中。(4)培养摇瓶种子在恒温室内的摇床上进行培养。摇床分旋转式和往复式两种。抗生素工厂常用的是旋转式。这种摇床由于主动轴和从动轴之间有一个偏心距(一般为25～50mm)，从向而旋转中产生振荡作用，以利于培养时气体交换。为了使摇瓶中的水分蒸发量保持稳定，恒温室也应控制一定的湿度。(5)保存摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果暂时不用，可置4℃冰箱中保存，保存期最好不超过3d。经过保存的摇瓶种子一般不用做生产种子，可用于摇瓶发酵实验或小型发酵罐实验。2．摇瓶种子的质量标准•摇瓶种子是液体培养的种子，在质量的控制方面，除了保证不污染杂菌及生产能力高这类与固体培养种子相同的一般标准外，还有其特殊标准。•(1)菌体浓度•(2)菌体生长阶段(1)菌体浓度•摇瓶种子以培养强生命力的营养菌体为目的，因而优良的摇瓶种子，首先要有一定的活菌体量。•在一定的体积接种之下，活菌量越多，意味着至下一级种子的接种量越大，下一级种子的生长就越快，生长质量一般也越好。•菌体浓度也不能太高，否则将影响摇瓶中的混合和气体交换，降低菌体生长质量。（2）菌体生长阶段•为了使摇瓶种子有较强的生长活力，同时又满足上述达到较高菌体浓度的要求，应将摇瓶种子的菌体生长阶段控制在对数生长的后期。•这一菌体生长阶段，本应由测得的菌体浓度变化曲线来确定，但摇瓶系统取样监测不现实，且测量结果滞后，通常只凭在一定培养时间内外观稠度的观察、静置沉降量或离心湿菌体积的测定以及显微镜检查的结果进行判断。3.影响摇瓶种子质量的因素及其控制•影响斜面种子质量的各种因素一般也影响摇瓶种子的质量。除此以外，还有以下一些因素必须予以注意。•（1）培养基组成•（2）摇瓶装量•（3）摇床转速•（4）摇瓶在摇床中的位置（1）培养基组成•培养基组成应能均衡地满足营养菌体生长对所有营养成分的需要。•在这一前提下，培养基组成越丰富，所能获得的菌体浓度就越高。•如果由于某一必需营养成分不足而打破了这种均衡，那么其它营养成分的丰富不仅不能促进菌体的生长，反而因代谢的失衡引起pH的波动或(和)毒性中间代谢产物的积累，而降低菌体浓度。（2）摇瓶装量•摇瓶装量影响摇瓶内的通气效果；装量越小，通气效果越好。•对摇瓶种子培养最合适的装量，随抗生素产生菌耗氧特性和摇床转速而异，应当通过实验来确定。•一般情况下，250、500mL和750mL摇瓶的装量分别为40～50、60～80mL和80～100mL，基本上可以满足各种抗生素摇瓶种子培养的要求。（3）摇床转速•摇床转速越高，偏心距越大，摇瓶内的气体交换速度就越快。•我国设计的摇床，一般偏心距为25mm，转速为200～300r／min。•但在使用中应经常检查传动皮带的松紧，皮带过松将使转速显著下降，从而影响摇瓶通气效果的摇瓶种子的培养。（4）摇瓶在摇床中的位置•由于代谢热和机械振荡热的生成，摇床瓶内的温度必然高于摇床室室温。•在摇床的不同位置，这种温差存在明显的差异。摇床上层的温度高于下层，中间的温度高于边缘。•由于这种差异，使在不同位置上培养的摇瓶种子呈现不同的菌体生长浓度和生长阶段，造成种子质量的波动。•为了避免这种波动，摇瓶种子的培养最好在具有相同温度带的摇床固定位置上进行。4．孢子接入量•对于丝状菌来说，孢子接入量对摇瓶种子的质量及其后的抗生素生产有很大的影响。•接入孢子量过少，延缓种子的生长及发酵前期的产物合成；•接入孢子量过大，能加速种子的生长和发酵前期产物合成的速度，但后期产物合成速度下降较快。•究竟采用多大的孢子接种量比较合适，对于每种抗生素的生产都应当通过实验来确定。第四节菌种保藏•在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一代谢产物能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。二、工业微生物菌种保藏技术(1)冷冻干燥或真空干燥保藏；(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；(3)转接培养或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。(一)冷冻保藏•冷冻保藏为最简单而有效的方法。•通过冷冻，使微生物代谢活动停止。•一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。•为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。•冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。•冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类一、普通冷冻保藏技术(-20℃)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)三、液氮冷冻保藏技术1.普通冷冻保藏技术(-20℃)•将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。•用此方法可以维持若干微生物的活力1～2年。•应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。•保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。•这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。2.超低温冷冻保藏技术(-60～-80℃)•要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。•在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：•(1)离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；•(2)用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；•(3)加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；•(4)混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。••如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。•超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1～2℃／min。•若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。3.液氮冷冻保藏技术(1)冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。(2)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤①冷冻保藏菌种悬液的制备a.从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养基；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，b.从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。②控速冷冻a.将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；b.将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；c.以1～2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；d.补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；e.细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；f.将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。③复苏a．从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；b．迅速将安瓿置于37～40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；c．用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1～0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。4.冻干保藏•冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。•此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。•冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。•大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。•而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。培养物的冻干过程(1)操作步骤①启动冷冻干燥器的致冷单元。当冷凝器的温度达到-40℃时启动真空泵，使真空度达到2.67～4.00Pa。②将冷冻槽置于歧管之下方。槽中装入2／3体积的异丙醇，然后插入温度计及可调温控仪降温探头。打开降温探头控制醇浴温度在-40℃，这一过程约需30min。③每支斜面加入2ml20％的脱脂乳，然后用巴氏吸管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌体均悬液，最终菌株浓度一般要求在106个／m1．用细菌浸没培养物来保藏时，加入40％的脱脂乳，混合制成含106个／ml的均悬液。4．取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分装安瓿(0.2ml／瓿)，重新塞好棉塞。5．轻轻振荡安瓿，以使细胞重新悬浮。将安瓿与歧管相联后迅速置于醇浴中，然后调节温控装置。使细胞悬液迅速冻结。6．15min后，将歧管与真空泵相通。7．维持-40℃的醇浴温度90～120min，然后调节温控装置。使醇浴温度上升至-10℃，维持2h。8．关掉可调温控装置的降温探头，让醇浴温度上升至室温(25℃)．9．在冷冻干燥的最初4h内应定期测真空度，在安瓿置于真空下后1h内，真空度必须达到13.33Pa，并于菌悬液接近干燥时逐渐降到2.67～4.0Pa。10．在真空状态下，让安瓿保存在冷冻干燥机中至少16h以获得完全干燥。11．干燥后，在2.67～4.00Pa的真空度下封瓶．12．在所有安瓿都封盖好后，撤去真空。13．关闭真空泵。14．关闭冷凝器。(2)冻干菌种的保藏与再生1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。2．复苏：(1)在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿．(3)在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。(二）其他保藏方法1.传代保藏2.矿物油中浸没保藏1.传代保藏•将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。•可用于实验室中若干菌种的保藏。•此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。•但此方法易发生培养基干