干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响

题目：植物生理学实验姓名：********学号：**********院系：生命科学学院专业：********干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响专业：******学号：*********姓名：********摘要：本实验以小麦幼苗为材料，设置对照组，探究了干旱胁迫下脯氨酸（pro）、谷胱甘肽(GSG)、丙二醛(MDA)、H2O2的含量变化以及抗氧化酶(POD、PPO)活性的变化。结果表明：在干旱胁迫下，脯氨酸（pro）、谷胱甘肽(GSG)、丙二醛(MDA)、H2O2的含量相对于对照组均有较明显的上升趋势，POD和PPO活性也表现出较大水平的提高。关键词：小麦；干旱胁迫；发芽率；生理生化指标引言：干旱、盐碱和低温是强烈限制作物产量的三大非生物因素,其中干旱造成的损失最大,其损失超过其他逆境造成损失的总和。干旱是我国农业可持续发展面临的主要问题之一，解决这一问题显得尤为重要。因此在这方面的研究工作开展许久，也取得了许多成果。小麦是典型的受干旱胁迫影响的植物，小麦是我国北方地区的主要粮食作物，但是近几年随着气候的变化，小麦产量安全问题日益突出。小麦的生长不仅受到自身遗传物质的控制，还受到众多环境因子的影响，如光、温、水和土壤营养物质等，而小麦生育后期干旱常常是限制我国北方地区小麦生长和发育的两个主要环境胁迫因子。干旱对小麦的生理、生化都产生重要的影响，进而影响小麦的生长发育、产量和品质。因此，为了减小环境对小麦生产的影响，有必要从小麦的各项生理生化指标含量的变化，来研究干旱胁迫对小麦的影响，从而找到合适的方法来解决干旱胁迫问题，解决小麦生产安全问题提供理论依据。1材料与方法1.1实验材料的选取和培养各取50粒吸胀的玉米种子，沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴20min）另50个半粒进行曙红染色（室温染色10min）根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。1.2干旱胁迫处理选取一定数量的小麦种子，小麦出苗后，生长达到一定程度后选出长势一致的小麦幼苗，取出矮小和长的高的植株，把长势一致的小麦幼苗分成实验组和对照组，将实验组进行干旱处理；对照组小麦苗仍然用蒸馏水浇灌继续培养。处理结束后，把小麦幼苗转移到26℃下恢复培养7天，每天光照12h，观察对比实验组和对照组小麦苗生长差异变化情况。1.3测定抗逆指标含量1.3.1测定抗逆指标抗氧化酶(POD)的含量运用紫外分光光度法测定。（1）提取：分别取对照组和实验组小麦苗0.1g作为实验材料，加入少许石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH6.0,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP），充分研磨后完全转入离心管中，再用2ml提取液洗研钵，5000rpm离心10min，取上清液并测量体积，用于测定POD和PPO酶活性。（2）POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50µl（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2min时的A470。（3）PPO测定：取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2min时的A410。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：用总显VVVtWA470PODactivities=(mol.g-1FWmin-1)用总VVtWA01.0410PPOactivities=(U.g-1FW)1.3.2测定抗逆指标脯氨酸（Pro）的含量运用紫外分光光度法测定。（1）提取：分别取0.1g实验组和对照组的小麦幼苗，加入3mL3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂，充分研磨后用2mL3%SSA冲洗研钵，用离心机5000rpm离心10min，取其上清液量体积。（2）测定：取上清液各2mL，分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂，水浴煮沸15min，冷却后再5000rpm离心10min（若没沉淀可略此步骤），分别测定A520。1.3.3测定抗逆指标GSH的含量运用紫外分光光度法测定。（1）提取：分别取0.1g实验组和对照组的小麦幼苗，加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂，充分研磨后用2mL5%TCA洗研钵，5000rpm离心10min，取其上清液量体积。（2）测定：上清液各1mL(空白用5%三氯乙酸代替)，分别加入2mL0.1MPBS(pH=7.7)、0.5mL4mMDTNB，然后于25℃下5min，测定A412。1.3.4测定抗逆指标ASA的含量运用紫外分光光度法测定。（1）提取：分别取0.1g实验组和对照组的小麦幼苗，加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂，充分研磨，用2mL5%TCA洗研钵，用离心机5000rpm离心10min，取其上清液量体积。（2）测定：上清液各0.8mL(空白用5%TCA代替)，分别加入0.8mL0.15MNaH2PO4(pH=7.4)和蒸馏水，混合均匀，分别加入0.8mL5%TCA、44%磷酸和4%联吡啶，摇匀，再加入3%FeCl30.8mL，于37℃下15min，测定A525。用总显VVVWLA520Procontent=(mol.g-1FW)用总显VVVWLA412GSHcontent=(mol.g-1FW)1.3.5测定抗逆指标可溶性糖和丙二醛（MDA）的含量运用紫外分光光度法测定。（1）提取：分别取0.1g实验组和对照组小麦幼苗，加入3mL10%TCA和少许石英砂，充分研磨后用2mL10%TCA洗研钵，5000rpm离心10min，取其上清液量体积。（2）测定：分别取上清液各2mL，加入0.6%TBA（用10%TCA配制）2mL，水浴煮沸12min，冷却后用离心机5000rpm离心5min（视沉淀有无），分别测定OD450和OD532。OD450=C185.4OD532=C17.4+15500C2求解方程得：C1/(mmol/L)=11.71OD450C2/(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450公式中C1为可溶性糖的浓度；C2为MDA浓度。1.3.6测定抗逆指标H2O2的含量运用紫外分光光度法测定。（1）提取：分别取0.1g实验组和对照组，加入3mL50mMPBS(pH=6.8，内含1mMHA)和少许石英砂，充分研磨后用2mLPBS洗研钵，用离心机5000rpm离心10mi，取其上清液量体积。（2）测定：分别取上清液各3mL，加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]1mL，摇匀，用离心机5000rpm离心10min，测定OD410。用总显VVVWLA525ASAcontent=(mol.g-1FW)用总显VVVWLA410H2O2content=(mol.g-1FW)2实验结果2.1种子发芽率的测定TTC法结果：48粒具有生命活力。曙红染色法结果：47粒具有生命活力。分别计算两种方法的发芽率：TTC法中，48／50=96%；曙红染色法中，47／50=94%。2.2脯氨酸含量的测定实验组：A520=2.186A,对照组：A520=0.06A，计算公式：Procontent=用总显VVVWLA520(mol.g-1FW)其中，V显=6ml，V总=5ml，V用=2ml，520=3.24mol-1.cm-1,L=1cm,W=0.1g.计算结果：实验组脯氨酸含量为101.204mol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为2.77mol.g-1FW.2.3抗氧化酶活性的测定POD活性：实验组为60.169U.g-1FW，对照组为44.068U.g-1FW.PPO活性：实验组为7.168×10-4mmol.g-1FWmin-1，对照组为3.828×10-4mmol.g-1FWmin-1。2.4GSH(谷胱甘肽)的含量测定实验组A412=0.540A,对照组A412=0.145A2.5MDA含量测得的结果如下表所示：OD450OD532实验组0.888A0.206A对照组0.199A0.062A最后计算得出浓度如下表：实验组对照组C1/（mmol/L）10.39852．3303C2/（mol/L）0.83140.28852.6H2O2含量计算结果如下：实验组的H2O2含量为194.0475mmol.g-1FW，对照组的为25mmol.g-1FW。3讨论本次试验我们的结果是，干旱胁迫小麦胚芽鞘中的脯氨酸(Pro)含量比正常小麦的多几倍，即干旱下小麦积累了脯氨酸(Pro)。已有很多试验证明了，干旱胁迫会使脯氨酸含量增加。脯氨酸（Pro）是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受干旱等胁迫时体内的脯氨酸含量明显增加。已有人证明了Pro的分解代谢开始于它的氧化分解，执行此功能的酶称为Pro脱氢酶(PDH)，它以FAD为辅因子将Pro降解为P5C，后者在P5C还原酶(P5CR)的作用下又重新合成谷氨酸，完成Pro代谢的循环过程。所以，在Pro的降解过程中，PDH是Pro降解的关键酶。在逆境胁迫过程中，PDH的活性往往受到不同程度的限制，从而削弱了Pro的降解过程，因此越来越多的脯氨酸被积累。两种抗氧化酶，多酚氧化酶和过氧化物酶在干旱胁迫中表现出不同的变化情况，多酚氧化酶的含量较正常组呈上升趋势，而过氧化物酶则呈下降趋势。过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶,它的作用主要是将过氧化氢水解。过氧化氢(H2O2)是氧化酶催化的氧化还原反应中产生的细胞毒性物质,氧化酶和过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中,从而对细胞起保护作用。干旱锻炼提高小麦幼苗抗旱性的抗氧化机理研究中已经指出，连续干旱锻炼的小麦幼苗体内的POD活性下降,羟自由基清除能力及总抗氧化力降低,总体上表现为抗氧化系统受到抑制。高等植物组织发生褐变主要是PPO作用的结果，PPO催化多酚氧化为醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果产生黑色素沉淀。PPO在植物中以潜伏PPO形式存在，与叶绿体膜紧密结合潜伏形式的通常在成熟、衰老或胁迫条件下，由于膜受伤害而活化，并导致PPO活性增加。所以综上所述逆境胁迫下多酚氧化酶的含量增加，而过氧化物酶则减少。干旱，小麦胚芽鞘中的可溶性糖(WSS)和脯氨酸(MDA)的含量都增加。同样，在《几种环境胁迫对小麦生理生化影响》一文中已经研究发现，干旱胁迫会使小麦中WSS和MDA含量增加。植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，其含量的多少代表膜损害程度。本次试验研究数据说明，干旱使小麦细胞膜系统受到一定的损害。H2O2在本次试验中的结果是，干旱组的含量更高些。过氧化氢酶大量分布于动植物细胞内，属于活性氧清除剂，对H2O2和羟自由基有清除能力，是一种细胞保护酶。大部分研究干旱胁迫对植物幼苗保护酶活性影响已经证明，在干旱胁迫中植物体中的过氧化氢酶活性前期升高，但到后期呈下降趋势。这间接证明干旱会是植物体积累过氧化氢。H2O2过氧化氢是植物代谢中产生的一种产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，在实验中，可根据其值的变化，来了解组织的破坏程度。因此，过氧化氢的含量也是植物逆境的一项指标。GSH的N细胞内稳定。（徐大勇等，2001），只能被某些特定-GTP清除。（Xiang等2001），GSH在细胞中分布并不均匀，如植物细胞30%分布于细胞质（May等，1998），Bl