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干细胞的研究与应用摘要干细胞指具有无限制分裂能力，同时亦可分化成特定组织细胞，在细胞生物发育阶段属于较原始时期的细胞。依干细胞可分化能力限制，又可分为全能干细胞和多能干细胞。由于干细胞具有这种分裂和分化的能力所以其成为组织再生，疾病治疗，逆转衰老等研究的实验材料。本文主要介绍几种干细胞相关的研究，并讨论干细胞的应用。关键词：干细胞；胚胎干细胞；成体干细胞；应用1.干细胞的定义干细胞是具有自我更新能力和多向分化能力的细胞。按干细胞来源及分化潜能，干细胞可分为全能干细胞和特定组织干细胞(成体干细胞来源于成体组织如脂肪组织、外周血、骨骼、皮肤和肝脏等)。前者能发育分化形成完整的机体，后者是一种或几种组织的起源细胞。按其分化的差异性分为全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞。2.miRNA与干细胞2.1参与干细胞谱系形成的信号通路例如而R-125的两个异构体(miR-125a和miR-125b)可以通过抑制人类胚胎干细胞表达SMAD4来调控神经元，导致SMAD2/3和SMAD1/5的磷酸化，促进神经峪和表皮细胞的自我更新。而RNA是缺血预处理信号的效应器，缺血预处理通过激活Akt和ERK1/2信号通路，向细胞核内转运低氧诱导因子（HIF）-1a显著减少骨髓间充质干细胞的细胞凋亡。miR-21通过调节成纤维细胞的EPK-MAP激酶信号通路来促进心肌细胞间质纤维化和心力衰竭，通过特异性抗体沉默miR-21的压力超负荷小鼠模型显示，心肌成纤维细胞EPK-MAP激酶活性明显下降，心肌细胞间质纤维化明显减轻，心功能明显改善[1]。2.2参与干细胞治疗口前研究表明，细胞从一种干性状态向其他形态分化的转变是通过染色质重构的表观遗传学机制及DNA的组蛋白修饰机制而实现的。最近miRNA作为一个新的角色已提出，这个小的非编码的mRNA可用于干细胞治疗，该假说已被证明，在早期胚胎发育中可表达而R-302/miR-367特定的胚胎干细胞，但在分化后迅速下降，因此，许多实验室开展了miR-302/miR-367介导的诱导型多能干细胞(iPSC)的研究。3.干细胞的种类3.1胚胎干细胞20世纪80年代初英国剑桥大学的Evans和Kaufman用延缓着床的胚泡、美国加州大学旧金山分校的Martin用条件培养基分别成功分离、体外培养了小鼠早期胚胎的内团细胞或上胚层细胞，建立了胚胎干细胞系。人胚胎干细胞是多能干细胞的主要来源，研究人员已经通过干细胞培养出血液、内皮、心肌、骨骼、神经细胞。胚胎干细胞（embryonicstemceIIs，ESCeIIs），是动物早期胚胎（桑椹胚或囊胚）或原始生殖细胞（primordiaIgermceIIs，PGC）经体外分化抑制培养筛选出具有发育全能性的细胞。它在发育阶段上类似于早期胚胎的内细胞团细胞（innerceIImass，简称ICM细胞），具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型的特点，兼有胚胎细胞和体细胞的类似特性，既可进行体外培养、扩增、转化和筛选，又可分化成包括生殖系在内的各种组织。Esc表达一些特殊的分子标志，如细胞内转录因子Oct3“、Rex一1和uTF一1等，碱性磷酸酶(AP)、阶段特异性胚胎抗原(SSEA—l、SSEA一3、SSEA4)、转录调控抗原(TRA一1—60、TRA一1-81)、同源蛋白转录因子(Nanog)等．在启动分化过程中，这些分子的表达量都有明显的下调[2]。3.2生殖干细胞1992年在哺乳动物的生殖腺首次发现了生殖干细胞，这一干细胞群目前多来源于新生或成年鼠睾丸或卵巢组织，终生具有再生功能，生殖干细胞表达多种干细胞表面分子。生殖干细胞的表面标记物主要有：DDX4、POU5F1(OCT3／4)和TFAP2C(AP一2y)。小鼠的生殖干细胞与胚胎干细胞在蛋白组学、表观遗传学以及一些干细胞相关基因修饰上具有很大的相似性。在胚胎发育早期，外胚层形成之前，伴随着原肠胚性腺的发育，外胚层的部分细胞发生着原始生殖细胞特化。在原肠期，来源于胚胎外胚层和内脏内胚层的骨形态发生蛋白作为旁分泌的信号使得近端外胚层的一小部分细胞特化成原始生殖细胞祖细胞，它的一些体细胞相关基因如Blimpl的表达受到抑制导致它们最终分化为生殖细胞系。特化的原始生殖细胞开始从它们发生的初始位置——后原条迁移向中胚层[3]。3.3诱导多潜能干细胞借助基因导入技术将某些特定因子导入动物或人的体细胞，同时可选择性地在培养液中加入特定的小分子物质，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞（iPS），此类细胞在克隆形态、生长特性、表面标志物、基因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体(embryoidbodies，EBs)形成、畸胎瘤(teratoma)形成和嵌合体(chimeras)形成(针对小鼠)等方面与胚胎干细胞非常相似。体细胞重编程为iPS细胞所需转录因子组合需根据体细胞种类及其相应转录因子表达水平或额外加入的小分子化合物加以灵活选择。一般Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4组合或Oct4、Sox2、Klf4组合即可将体细胞重编程为iPS细胞，只是后一种组合重编程的效率较前一种低许多。当选用小分子化合物时，可大幅度提高重编程效率和/或减少转录因子使用个数，增加转录因子使用个数(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc和Klf4)，也可大幅度提高重编程效率．又如Oct4和Klf42种基因，甚至只用Oct4一个基因，即可将神经干细胞或前体细胞转化成iPS细胞，这主要由于这些细胞本身高表达Sox2、c-Myc和Klf4，而当在培养液中加入小分子化合物BIX或PD0325901与CHIR99021，则可显著提高重编程效率．Oct4和Klf42种因子与小分子化合物BIX和Bay组合联用时，可高效率将小鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞，这时BIX和Bay可以弥补外源Sox2的缺失，这是由于小鼠成纤维细胞重编程为iPS细胞至少需要Oct4、Sox2和Klf43种因子．小鼠成熟B细胞需要导入Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和C/EBP5种基因才能转化成iPS细胞，而当在培养液中加入5-AZA，Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc4种因子亦可将成熟B细胞诱导为iPS细胞[4]。目前，通过逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和转座子介导的方式均可将转录因子对应的基因导入体细胞，进而将其重编程为iPS细胞。将体细胞重编程为iPS细胞只需转录因子基因在体细胞内瞬时表达即可达到目的，而无需病毒载体整合进宿主细胞基因组中，但是该方法将体细胞诱导为iPS细胞的效率较逆转录病毒和慢病毒的低许多。非整合方式实现体细胞重编程为iPS细胞的理论基础是：在通过逆转录病毒介导的方式将转录因子基因导入体细胞而获得的iPS细胞上检测发现，转录因子转基因表达水平非常低或外源转基因完全沉默，而内源性转录因子基因被激活而维持很高表达水平，这时iPS细胞多潜能性靠内源性转录因子表达来维持，至此，外源转录因子转基因已完成自己的使命而不表达。诱导性多潜能干细胞研究飞速发展，虽然现阶段诱导性多潜能干细胞还不能完全取代传统干细胞研究，技术也存在一些有待解决的问题，但是今后诱导性多潜能干细胞的研究会成为生命科学领域的一个重要方向，随着研究的不断深入，在提高转化效率和安全性后，诱导性多潜能干细胞将有望应用于临床治疗。3.4脐血干细胞1974年Kandlzon等首先发现脐血中含有造血祖细胞。随后1982年Nakahata等发现脐血中的造血祖细胞的产率高于骨髓。Cardoso等比较了骨髓和脐血CD34+、CD38-细胞群的分化增殖能力和在长时间培养中产生早期祖细胞的能力。在脐血中CD34+、CD38-组分占CD34+群的4%，而在骨髓中只占1%，脐血可能含相对丰富的干细胞。2009年罗利民等以新生儿脐血分离出的间质干细胞，通过尾静脉输入60Coγ射线照射小鼠体内，照射后当天再次输注人脐血间质干细胞，证实脐血间质干细胞静脉输注对辐射造成的脾细胞损伤有一定保护作用，可促进脾脏细胞分裂增殖，加速脾脏细胞修复[5]。3.5脂肪干细胞2001年发现脂肪组织中除了含有已经定型的前脂肪细胞外，也包含一种具有多方向分化潜能的细胞群，其性质与骨髓间充质干细胞相似，这种细胞可以分化成多种组织如骨骼、软骨、脂肪、心肌、神经等组织，同时可以促进伤口愈合、损伤组织细胞再生和减少瘢痕的能力及抗衰老能力[6]。4.干细胞分化的体外诱导4.1碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,BFGF)是一种含有多个氨基酸的碱性蛋白质，可促进神经细胞生长及神经纤维再生，并诱导干细胞向神经元分化。碱性成纤维细胞生长因子广泛存在于神经系统中，对其具有营养作用，单独使用BFGF能诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞，表达神经元特异性标志物，当然它也能够与其它生长因子协同作用修复神经损伤。研究表明BFGF与心血管疾病密切相关，能够调控基质细胞及成熟血细胞的生长，参与生理性和病理性造血;它还能促进心肌细胞的增殖及毛细血管的形成。4.2表皮生长因子表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)是一种小分子肽，具有促进神经细胞和树突生成的作用。EGF常用于干细胞的诱导，维持干细胞的未分化状态，并与细胞有丝分裂以及糖、蛋白质、DNA,RNA的合成有关，所以能够促进细胞分裂增殖。研究表明EGF能诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，并表达神经细胞特异性蛋白NeuN和NF-200。4.3自体脑脊液脑脊液是一种无色透明的液体，略带豁性，由脉络丛产生，含有多种生长因子、电解质、蛋白质以及糖，如碱性成纤维细胞生长因子、胶质细胞源性神经营养因子和脑源性神经营养因子等。使用DNA测序方法检测BM-SC、细胞膜上，发现上面存在多种细胞因子的受体，其中就包括碱性成纤维细胞生长因子、胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子等。4.4拘祀多糖拘祀多糖是由宁夏拘祀提炼得到的含有多种微量元素和氨基酸的蛋白多糖，临床上具有调节免疫、抗肿瘤、延缓衰老等功效，近年研究表明其具有很强的抗氧化作用，可以清除超氧阴离子和经自由基，具备诱导剂的基本条件。4.5红花黄素红花黄素是由中药红花提取而制成的中药注射剂。大鼠脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)时，腹腔注射红花黄素能减少继发性损伤，并能促进移植的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤区域的存活和分化，增加神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)的分泌，加快SCI大鼠的神经功能恢复。4.6与星形胶质细胞共同培养星形胶质细胞是神经组织中一种重要的细胞，它在神经系统发育时为神经元提供支架，并能合成成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、神经生长因子等多种生长因子，在神经发育及损伤再生中具有关键性作用。星形胶质细胞与骨髓间充质干细胞共同培养可以维持其生长，并在一定程度上诱导其向神经样细胞分化。4.7与施万细胞共同培养施万细胞(Schwancell,SCs)是外周神经所特有的神经胶质细胞，它能分泌多种神经营养因子，在神经系统的发生及发育中起着重要作用。研究显示，将骨髓间充质干细胞与SCs共培养，可促进骨髓间充质干细胞分化为成熟的神经细胞，并表达神经元特异性标志物。4.8干细胞的分化机理体外培养下,胚胎干细胞的不分化的多能性目前均是靠加人外源的白血病抑制因子来维持,这些细胞因子通过信号受体复合物gp130激活Janus酪氨酸激酶及Stat(signaltransducerandactivatoroftranscription)的信号级联传导来作用于胚胎干细胞内的靶基因。缺失功能性gp130,则Sat活性降低,进而导致白血病抑制因子不能抑制胚胎干细胞分化胚胎干细胞当用维甲酸诱导或撤除白血病抑制因子而出现分化时,酪氨酸磷酸化的Stat-3含量迅速降低,说明其DNA结合活性降低与Stat-3参与诱导体细胞类型的分化作用相反,Stat-3活性水平对于维持胚胎干细胞未分化状态起决定作用但同时,Stat-3的活性变化并不影响胚胎干细胞的增殖多潜能的增殖