幽门螺杆菌感染的诊断方法及评价

幽门螺杆菌感染的诊断方法及评价徐采朴一、幽门螺杆菌的分离培养方法自从Marshall及Warren1982年首先由人胃粘膜分离培养幽门螺杆菌（Hp）以来，因其结果呆靠，已被认为是诊断Hp的“金标准”，用以评估其他诊断方法及体外试验。1.标本收集与转送胃镜活检胃窦粘膜后应立即在培养平板上划线分离或置于转送基内，及早（最好小时内）进行分离培养。2.将2－3块胃粘膜组织放在灭菌河沙中，加菌水研磨，以1000r/min离心3分钟，取上液再以35r/min离心20分钟，除上液，取沉淀物接种于含脑心的改良SKirrow血琼脂平板上，置微氧环境（5％O2，80％N2，8％CO2，7％H2），湿度较充分的玻缸中，370C培养3－4天。对可疑菌落（0.5-1.0mm大小的扁平菌落）作涂片染色和4种生化试验。凡革兰染色阴性、菌形典型、且角酶、氧化酶、尿素酶等试验吴现阳性，而马尿酸钠水解试验吴阴性者，确诊为Hp。凡7天培养仍无可疑菌落生长者为阴性。3．Hp分离培养法是诊断研究的一基基本技术，但由于技术要求高、操作繁琐，时间长且阳性率不很高，敏感性70－92％，特异性100％，有胃镜取材之苦，故不列为临床诊断常规，而作为评价新的诊断方法、药物根除效果及体外筛检抗菌药物之用（体外药物敏感试验）。二、组织学检查方法组织学检查亦被认为是诊断Hp的“金标准”，其敏感性93－99％，特异性96－99％，常用方法有：1.WarthinStarry银染色法被认为是经典的方法，Hp呈黄色，菌体由于有银沉着而显增大，容易识别，敏感性及特异性均高，达95％左右，但技术度要求高，操作繁琐，价格刘而费时，有被取代之趋。2．改良Giemsa染色法组织切片脱蜡，充分复水后，直接入2％Giemsa染液中30分钟后洗去染液，用100％乙醇脱水。Hp呈紫红色，形态清晰易于辨认，效果与银染相似，甚至更好，并且操作简便，价廉省时，易于一般医院普及。3．甲苯胺兰染色法组织切片脱蜡复水、水洗后用0.1%甲苯胺兰染色10分钟，洗去染液，Hp着兰色。4．HE染色法组织切片脱蜡复水后用苏木素液染色15分钟，洗去染液用1％盐酸洒精分化。流水冲洗15分钟后伊红染色5分钟，结果Hp染成淡红色。5．组织印片Giemsa染色法用无菌镊子胃镜活检组织块，放在无菌载玻片上，以组织的不同面作印，然后染色镜检。Hp多在粘液层下，粘膜上皮细胞表面，呈弯曲杆状、海鸥展翅状、螺旋状、两端钝园、着色较淡。三、血清特异性抗体检测法应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测患者血清特异性抗Hp的IgG和IgM抗体。1．Hp超声粉碎抗原的制备经鉴定确诊的5株Hp，在改良Skirrow培养基，微需氧370C条件下培养3天。以PBS洗下菌落及菌苔。TOHY超声破碎品昌200W，20000Hz,30分钟将Hp打碎，－200C5000r/min离心30分钟。取上清液加入NaN3至最浓度0.1%，40C储存备用。2．Hp阳性参考血清的制备3株Hp活菌分别接种家兔5只，28天采血。凝集效价均在1：1200以上，混合使用。3.ELISA基本程序经方陈滴定择最佳抗原浓度，包被聚苯乙烯微孔板，加入倍比稀释的被检血清，温育、洗涤后分别加入辣根过氧化物酶标记的抗入IgG和IgM，温育，洗涤后加入底物显色，终止反庆。酶联检测仪测定OD值。每板设置阴、阳性对照。大于或等于阴性对照平均OD值3倍或以上者为阳性。本组结果：IgG诊断特异性和敏感性分别为76.2%和95.2%。IgM分别为93.9%和97.1%。该法为无创性诊断方法适用于流行病学调查，缺点是不能诊断Hp现行感染，Hp被根除后，血清中抗体可以维持阳性超过半年，故不能用以判断疗效。四、聚合酶链反应检测Hp聚合酶链反应（PCR）技术是1985年发明，1990年Hoshina等首先应用，成功地检出胃粘膜活检标本中Hp。1．原理利用两条与靶DNA两端互补的寡核苷引物，经酶促反应合成特异片断的体外扩增技术，包括：⑴变性：膜板DNA加热后双链解离成两条单链；⑵退火：降温时，两个引物分别结合至两条模板的3`端；⑶延伸：在DNA聚合酶催化下，自引物的3`端开始单核苷酸，形成与模板链互补的新链，后者又可作为模板进入上述循环，经25－30个循环后即可扩增106－109倍。2.操作方法及步骤包括：⑴模板DNA的制备：⑵扩增反应：⑶PCR扩增产物的凝胶电泳分析。3.结果特异扩增应在电泳中仅出现一条DNA条带，通常电泳阳性即可诊断Hp，亦可与扩增片段互补的探针杂交获得更确切的证明。PCR检测胃液及活检组织的敏感性96％－100％，特异性为100％。宋敏等报告，其敏感性97.3%，特异性100%，认为PCR有高效、特异、敏感、简便、迅速和可自动化等优点，可检测少至100个细菌的水平，已逐步用于检测难以培养的球形Hp以及胃液、唾液内的Hp为流行病学研究的较理想的方法。五、快速尿素酶试验由于Hp是胃内唯一能产生大量尿素酶的细菌，故可通过检测尿素酶来诊断Hp感染。快速尿素酶试验应用最广，若观察24小时基灵敏度为89－98％，特异性为93－98％。1．pH试纸水素酶检测取pH变色范围为4.0-10.0的试剂平放于二皿中的新华滤纸上，高压灭菌后备用。将活检取得的活检组织块紧贴于试纸的中央。在组织块上滴两小滴用无离子对配制的10%尿素溶液（其量恰可使纸条湿润），15分钟后观察结果。凡组织块周围碱性变(pH8.0以上)并向四周扩散，直径达12mm以上以者为阳性，否则判为阴性。2.HpUT试剂盒国同三强公司产品。其配方：尿素5－10g,酚红0.2%，磷酸地氢钠（一水）0.218g，磷酸氢二钠0.5g叠氮钠0.1g，当胃粘膜组织块放入后立即变红色，或紫红色为强阳性，有报告不同时间的阳性率：20分钟时75%，1小时85%3小时90%24小时95%。3.CLO试剂盒国内外有生产，系液体尿素酶试剂加入1％浓度的琼脂粉，加热溶解，冷却后即成半固体尿素酶试剂。六、微量胶囊法14C－尿素呼气试验1995年我们首先应用胶囊微量法，对14C－UBT加以改进及完善。（一）试剂配制取14C－尿素（Sigma）母液(1чCi/1.2ml)10чl(含14C－尿素8чCi)溶于4ml无菌水中，加非标记尿素80mg，配成浓度2чCi/ml溶液。每次用0.5ml（含14Ci－尿素1чCi，非标记尿素10mg）。将配制的溶液置－40C冰箱中备用。（二）操作步骤及具体方法1．呼气收集方法：病人通过一长约20cm带滴球的一次性输液管向加有1ml氢氧化海胺甲醇液(0.5mmol:sigma)，1ml无水乙醇，1%酚酞1滴的闪烁瓶内液体吹气，当紫红色液体变为无色时，即提示CO2饱和。将5ml闪烁液(含0.7%PPO,0.05%POPOP的二甲苯液)加入，每份标本在LKB1217型液闪计数仪（LKB1217）作计数测定，经猝灭校正后得dpm值。减去本底后以各时相点两瓶的平均值作为14CO2的放射性活度（dpm/mmolCO2表示）2.具体方法：患者在内镜检查同周内行呼气试验，参照Marshal方法，并在2.5чCi14C尿素，无营养性试餐方法的基础上进一步完善、改进，首创胶囊微量法。为避免口腔尿素酶干扰及减少同位素放射量，将14C-尿素从一般剂量10чCi，5чCi，以及我们前一阶段用量2.5чCi再减少至1чCi。试验通过盲法处理。第一阶段预试验将胃镜检查5天内已确定Hp阳性看作为对象，确定14CO2呼出高峰期及监界值。禁食12小时，收集呼气2瓶作为本底，取14C-尿素溶液0.5ml（含1чCi，37kBq14C-10mg非标记尿素），迅速注入零号空胶囊（明胶）中，瞩病人立即用20ml水吞服，从注入液体至胶吞入在30秒钟内完成。收集5，10，15，20，25，30，45，60分钟的呼气各2瓶。结果：14CO2活性高峰期拓25分钟临界值为280dpm(14CO2放射量均值＋3S)。第二阶段正式测定。在胃镜检查后5天内进行，仅收集0，10，25，分钟呼气标本各2瓶，结果与金标准（细菌培养和／或病理组织学结果）对照。Hp阳性人指培养或活检标本Giemsa,Warrthin-starry染色发现Hp者。Hp阴性指上述检查未能发现Hp者。结果：本试验的敏感性为97.06%。特异性为95.12%。阳性预检值为97.06%，阴性预检值为95.12%，诊断符合率为96.33%。（三）临床意义1.胶量法的可靠性我们在原有2.5чCi-UBT基础上建立了胶囊微量法14C-UBT，将14C-尿素从一般用量10чCi,5чCi减少至1чCi胶囊给药，不仅减少了病人同位素负荷，且价廉、简便，消除了口腔尿素酶的干扰，还减少了环境污染的可能性。通过与金标准结比结果可靠。2.优点（1）显著减少病人同位素负荷及环境污染的可能性胶囊微量法用1чCi14C-尿素得到的Hp阳性病人dpm值3188（Hp阴性为42dpm）显示，底物与Hp反充分反应。以达到区别阳性和阴性的目的。现有的报道资料显示并未因14C－尿素用量大而解决尿素酶定量问题。因此单纯增加14C－尿素用量不仅增加病人射线内照射量，造成环境污染，而且浪费试剂。Munster等的报道14C－尿素吸收后在体内长期贮留量很低。尽管如此，我们认为减少14C－尿素用量不仅能减少病人同位素负荷量，而且可以养活病人排泄物用14C－尿素容器造成的环境污染。胶囊微量法用的1чCi(37KBq)辐射量仅为一次上胃肠钡暴露量，其安全性显而易见。(2)经济价值目前国内用于14C－UBT的14C－尿素及氢氧海胺均为进口。本试验较传统14C－UBT便宜约9倍，尤其适合我国国情。(3)避免口腔尿素酶干扰Marshall的研究已证明口腔细菌产生可分解14C－尿素产生14CO2污染呼出气体。通过胶囊给药避免了14C－尿素酶的接触。得到了与食管插管给药相同的结果，免除了食管插管的痛苦，也更为简便并节约了时间。