实验一特殊显微镜及其使用.

细胞生物学实验汕头大学生物系游翠红本实验课共36学时，由12个实验组成。实验内容1、特殊显微镜及其使用2、线粒体和叶绿体的分离3、巨噬细胞的吞噬实验4、ACP、过氧化物酶等的显示5、小鼠骨髓细胞染色体标本的制备6、动物细胞染色体分带技术实验要求永久制片—实验开始前细查张数及有无破损清点器械实验报告实验室卫生节约规范实验一特殊显微镜及流式细胞仪的使用1、口腔上皮细胞2、活细胞（细胞系）3、培养的紫菜或小新月菱形藻4、流式细胞仪的演示实验所需的材料：实验所需的试剂：香柏油、乙醚:酒精=7:3暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜实验目的：掌握暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜及流式细胞仪的原理、构造及其使用方法。学习特殊显微镜操作的目的：暗视野显微镜：看到运动的物体，利用目标物体的轮廓与背景区分开荧光显微镜：辨别含有荧光物质所在的位置一、暗视野显微镜1.原理利用暗视野聚光器（或挡板）使入射光束的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜，只能倾斜地照射在观察的标本上。标本遇光发生反射或散射，物镜接触不到入射光源的光线，只能接触标本的反射和散射光。因而整个视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的，使在黑暗的背景上呈现出明亮的像。丁达尔现象斜向照明2.操作方法（P14）1.安装暗视野聚光器（或挡板），放在普通显微镜的聚光器下方。2.加香柏油：把被检样品的标本置于载物台上，并在聚光器透镜的上表面滴香柏油。向上缓慢调升聚光镜，使香柏油与载玻片下表面缓缓接触。加香柏油的原因，避免照明光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体。3.聚光器光轴的调中：用低倍镜对样品聚焦，随之用聚光器升降螺旋上下缓慢调节聚光器位置，当暗视野中清楚地窥见一光环或圆形光点时停止什降聚光器，用聚光器调中杆推动聚光器，把光环或光点调至视野中心；4.调节聚光器焦点，使之位于被检样品处，转动聚光器升降螺旋，使视野中光环调成一最小的圆形光点，此刻聚光器的焦点恰好位于样品处。注意事项物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径；制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁无痕；必须使用薄玻片(载玻片厚度约0.8~1.1mm，盖玻片厚度约0.1mm)，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就不能看到物象；标本也不能过厚。采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物象不清晰。用途：1）利用样品的散射光和反射光进行观察，只能看到物体的存在和运动，不能辩其细微结构；2）可以看到许多细胞器的明亮轮廓，如细胞核，线粒体、液泡等3.实验内容、材料与仪器内容：口腔上皮细胞的观察材料：口腔上皮细胞试剂：蒸馏水器材和仪器：载玻片、盖玻片、显微镜、牙签二、相差显微镜1原理光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。相差：同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（光程差），介质越厚或折射率越大，光波减速也越大。肉眼看不到的相差，利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差)，就可以看到。相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：1）用环状光阑代替可变光阑2）用相差物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜；3）带有一个合轴调中望远镜CT:用于环状光阑的环孔与相差物镜相板共轭面的环孔（暗环）在光路中准确合轴，使成像的相位差变为振幅差；4）有绿色滤色片：用于消色，可吸收红色和蓝色光，只透过绿光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果2结构特点相相差差附附件件1.灯箱2.滤色片座3.相衬环杆4.相衬环调节螺钉5.目镜6.三目头7.手轮松紧张力圈8.粗动调焦手轮9.电源插头10.电源插座11.微动调焦手轮12.物镜13.载物台14.聚光镜调节螺钉15.聚光镜托架16.孔径光栏调节转环17.灯座调节螺钉18.视场光栏调节手柄19.聚光镜固紧螺钉20.聚光镜升降手轮21.移动工作台22.纵向移动手轮23.横向移动手轮24.电源开关25.亮度调节旋钮26.移动机构固紧螺钉27.升降限位固紧手柄28.镜筒固紧螺钉29.观察摄像拉杆30.集光镜调节手柄31.聚光镜刻度处3使用方法：倒置相差显微镜（科技楼516室）的使用方法：先打开电源开关，再打开汞灯，然后光圈对准最右边的Ph模式（相差模式，其它数字表示明场），此时表示Ph模式下，光圈最大，再转动下面的转盘，选择Ph0，表示放大5倍，底下物镜相应用5倍目镜；选择Ph1，表示放大10倍或20倍，底下物镜相应用10倍或20倍；选择Ph2，表示放大40倍，底下用最大的40倍物镜。拍照时，将右边的拉杆拉出。双击电脑上的软件图标，选择Preview按钮，选择set可以拍照，选择Autoset按钮可以电脑自动调整照片亮度。然后点击保存图标，保存在电脑上。4用途：用于观察组织培养中活细胞形态结构或未染色标本。5、标本活细胞荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的可见荧光，再通过物镜和目镜的成像、放大，以供检视和拍摄。1、原理三、荧光显微镜当一个物体吸收了紫外光或者短波光的能量，它能发射出比原来吸收的波长更长的光。这种波长长于激发光的可见光称为“荧光”。荧光显微镜具特殊光源，提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光。自发荧光（不加染色）：有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。二次荧光（用化学染色）：非荧光性的物质（蛋白质、碳水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。抗体荧光技术（用免疫染色）：利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。荧光染色分类：普通光学显微镜加附件：1)荧光光源2)激发滤片3)双色束分离器4)阻断滤片等的基础上组成的。2、荧光显微镜的基本装置及其光路2.1基本装置荧光显微镜内部构造（反射式）2.2、光源：采用高压汞灯。由于荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强度必须很高，即使在近紫外区，也必须有足够的强度。为了满足这些要求，通常采用高压汞灯。使用中严禁频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，不可切断电源，可用光阀阻断光路。激发滤色镜(exciterfilter)为被检样品的荧光燃料提供最佳波段的激发光。加放于汞灯和二向色镜之间，物镜之前。2.3、滤色镜系统激发方法代号主波长紫外UV365nm紫V405nm兰紫BV436nm兰B，B2495nm绿G546nm几种主要的激发滤色镜阻断滤光镜(barrierfilter)：位于物镜之上，二向色镜与目镜之间，用以阻断或吸收没有被标本吸收的激发光，以防伤害眼睛，使荧光透过。在荧光中也仅有部分波长被选择透过。选用的原则，以能完全阻断或吸收波长长于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧光。2.4、荧光显微镜的光路因荧光激发的方式不同，分为：透射荧光显微术光路反射荧光显微术光路透射荧光显微镜光路图反射荧光显微镜光路图汞灯激发滤镜集光镜目镜阻断滤镜二向色镜物镜样品3、荧光显微镜的分类：3.1.透射荧光显微镜：光源：高压汞灯或卤素灯。聚光镜：使用暗场聚光镜，使激发光和荧光分离出来。物镜：可用任何种类的物镜。标本：因为是透射观察，薄的标本比较适合。缺点：•必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。•由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。•视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。•厚的或不透明的标本不适用。优点：•由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。•由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。•用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。3.2.反射荧光显微镜：光源：高压汞灯或卤素灯。聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。优点：•由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。•采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。•物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高分辨率的像。•厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。•其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。•可以避免不必要的荧光色衰褪现象。1）打开灯源开关（汞灯及普通灯光源），超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。2）反射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。3）放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；4）高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。5）先在普通光源下（数字调为1）用10倍物镜调整好玻片的焦距，后转至40倍物镜。材料目标与焦距调好后，关闭普通光源的电源（或用载物台下面的挡板将来自下面的普通光源挡住），数字调至2-4，其中2为红色激发光，3为蓝色激发光，4为绿色激发光，蓝色激发光波长最短，一般应用蓝色3，即可看到荧光照片。荧光显微镜主机的上部分右侧分别有调整荧光光圈、光强的拉杆及照相拉杆。4、使用方法（反射荧光显微镜）5、用途1)观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构2)标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。3)细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。4)荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）内容：荧光显微镜下观察单细胞藻类材料：小新月菱形藻仪器：载玻片、盖玻片、荧光显微镜6、实验内容、材料与仪器1、FCM的结构可分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光速形成系统；③光学系统；④信号检测与存储、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。2、FCM的工作原理：1）将待测细胞染色后，制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压人流动室，同时，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。四、流式细胞仪(flowcytometer,FCM)2）流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光信号和荧光信号。①散射光信号分为前向角散射光信号(FSC)和与激光束成90°收集的侧向角散射光信号(SSC)。FSC基本上反映细胞体积的大小，通常在FCM检测作为阈值来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒；SSC主要反映细胞的颗粒特性，可以区分淋巴细胞、单核细胞及粒细胞。②荧光信号主要代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，荧光信号在被检测前还需经过一系列双