搜索
高级植物生理实验报告植物营养农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1植物组织铵态氮含量的测定（茚三酮比色法）一、实验原理植物吸收的氮主要是氨态氮和硝态氮，后者经过还原过程形成氨，前者经同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白质。测定氨态氮的方法有多种，本实验为改良的茚三酮比色法。α-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的α-酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮则被还原，在弱酸环境中，还原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。根据蓝紫色的深浅，在580nm波长下测定吸光值。本实验中在茚三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇和丙醇，可以克服茚三酮的不稳定性。二、仪器设备研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、三角瓶、容量瓶、移液管、天平、沸水浴锅、可见分光光度计三、试剂1.10%醋酸(100mL)2.1%抗坏血酸（100mL）3.5μg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g定容至1000mL）4.pH5.4醋酸缓冲液：8.8mL0.2mol/L醋酸（冰醋酸11.55mL稀释至1000mL）加41.2mL0.2mol/L醋酸钠（醋酸钠16.4g或三水醋酸钠27.2g配成1000mL）。5.水合茚三酮试剂：1.1g茚三酮放到烧杯中，加入15mL正丙醇，摇匀，溶解，后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇，混匀，再加9mLpH5.4醋酸缓冲液，混匀。保存于棕色瓶中，冰箱保存，适用期限10天。四、操作步骤1.标准曲线的绘制以下表所示量从5μg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液并在每个试管中加蒸馏水至2mL，对照加2mL蒸馏水，后在各试管中加入3mL水合茚三酮试剂和0.1mL1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟，取出后搅拌冷却15分钟。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，在波长580nm处测吸光值，以铵态氮浓度（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。试管号1234567试剂（mL）00.20.40.81.21.61.8铵态氮浓度00.512345（μg/mL）2.称取0.5g新鲜植物材料，放入研钵中，加入5mL10%醋酸，研磨后以蒸馏水稀释至100mL，混匀，通过滤纸过滤，弃去最先滤下的一部分滤液后过滤到100mL三角瓶中。3.从剩下的滤液中取2mL放入试管中，加3mL水合茚三酮试剂和0.1mL1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟。同时将盛有对照溶液（提取液用蒸馏水代替）的试管加热。4.取出后搅拌冷却15分钟。加热形成的红色茚三酮试剂被氧氧化而褪色，茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色反应产物仍然存留并变得更加鲜明。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，混匀。在波长580nm处测光密度值，根据标准曲线查得数值代入以下公式计算铵态氮含量。样品c值:1.436、1.435、1.436、1.435（0.1×10×C）X（100g样品中的氨态氮毫克数）=×100（2×n）C：比色液中氨态氮浓度（μg/mL）10：比色液体积（mL）n：样品重量（g）100：分析溶液总体积（mL）0.1：μg换算成mg并折算成100g物质中含量的换算系数。实验2植物体内硝态氮含量的测定一、原理在浓酸条件下，ＮＯ３－与水杨酸反应，生成硝基水杨酸。生成的硝基水杨酸在碱性条件下（ｐＨ１２）呈黄色，最大吸收峰在波长４１０ｎｍ处，可直接比色测定。二、仪器和设备分光光度计、天平、刻度试管、移液器、移液管、容量瓶、漏斗、水浴锅、滤纸三、试剂1.500mg/LＮＯ３－-N标准溶液：称取KNO30.3611g溶于蒸馏水中，定容至100mL。2.5%水杨酸-硫酸溶液：称取5g水杨酸溶于100mL浓硫酸中，搅拌溶解后，贮藏于棕色瓶中。3.8%NaOH溶液：8.695gNaOH溶于100mL蒸馏水中。四、方法1.标准曲线的制作（1）吸取500mg/LＮＯ３－-N标准溶液0,1,2,3,4,6,8mL分别放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，使之成为0、10、20、30、40、60、80mg/L的系列标准溶液。（2）吸取上述系列标准溶液0.1mL，分别放入刻度试管中，以0.1mL蒸馏水代替标准溶液作空白。再分别加入0.4mL5%水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20分钟后，再加入8%NaOH溶液9.5mL，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10mL。（3）以空白作参比，在410nm波长下测定光密度。以ＮＯ３－-N浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线并计算出回归方程。2.硝酸盐的测定（1）样品液的制备：取2g植物材料切碎后放入刻度试管中，加入10mL蒸馏水，封口。置于沸水浴中提取30分钟，冷却，将提取液过滤到25mL容量瓶中，并反复冲洗残渣，最后定容至刻度。（2）样品液的测定：吸取样品液0.1mL分别放入刻度试管中，加入5%水杨酸-硫酸溶液0.4mL，混匀后置室温下20分钟，再慢慢加入9.5mL8%NaOH溶液，待冷却至室温后以空白作对照，在410nm波长下测定光密度值。在标准曲线上查得或用回归方程计算出ＮＯ３－-N浓度，再用以下公式计算其含量。ＮＯ３－-N含量（mg/g）=（D×样品液总量）/样品鲜重D：标准曲线上查得ＮＯ３－-N浓度（mg/L）实验数据统计实验四植物营养4.1植物体内硝态氮含量测定硝酸根离子含量和吸光值标准曲线如下所示：如图所示：标准曲线相关性系数为0.9344，线性关系良好y=0.0074x+0.1309R2=0.934400.10.20.30.40.50.60.70.80.9020406080100浓度吸光值吸光值线性(吸光值)样品硝态氮含量两重复分别为：1.435、1.436，平均值为1.4355.则每100g鲜马铃薯中硝态氮含量为1.4355mg/100g4.2植物体内铵态氮含量测定根据铵根离子浓度和吸光值得到的标准曲线如下：y=0.0253x+0.0906R2=0.95100.050.10.150.20.25012345铵态氮浓度（μg/ml）光密度值