实验三细菌芽胞染色

实验三细菌芽胞染色一．实验目的1．学习并掌握细菌的芽孢染色法。2．了解并观察细菌芽孢的结构和形态。二．实验原理1.芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子（endospore），通常为圆形或椭圆形。是否产生芽孢及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。2.芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而便于区别。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽孢一旦着色就难以被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿或石炭酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍然保留。再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。三．实验器材1．菌种：枯草芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌2．溶液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、二甲苯、香柏油、蒸馏水、95%乙醇3．器材：显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸四．实验步骤1．制片取一块载玻片，在中央滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作从枯草芽孢杆菌（梭状芽孢杆菌)斜面上挑数环菌置于载玻片液滴上，小液滴呈混浊状即可。并按常规方法干燥、固定（每隔几秒在酒精灯火焰上过一遍）。2．加热染色向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽（此时开始计时）并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。3．脱色待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。4．复染用0.5%的番红水溶液复染2min。5．水洗用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。6．镜检待载玻片自然干燥后油镜镜检，观察芽孢的形态并绘图。五．实验结果与分析1.枯草芽孢杆菌（油镜）局部放大细节图12.梭状芽孢杆菌（油镜）局部放大细节图2细菌类别菌体形态芽孢形态芽孢位置枯草芽孢杆菌长杆状椭圆到柱状菌体中央或稍偏梭状芽孢杆菌膨大呈梭状、鼓槌状圆形或卵圆形，直径大于菌体菌体中央、极端或次极端六．注意事项1.选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已破裂。2.加热时使用载玻片夹子，以免烫伤。3.使用染料时注意避免沾到衣物上。4.加热染色时必须维持在染液微冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。5.加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。6.脱色必须等待玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。七．思考与讨论1.为什么芽孢染色需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢?答：芽孢是整个生物界中抗逆性最强的生命体，只有加热时芽孢的渗透性发生了变化，染液才能渗透进入芽孢，所以芽孢染色需要加热。简单染色不能观察到芽孢，因为简单染色法没办法给芽孢着色。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，芽孢染色一般是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。2若在你的制片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。答：芽孢染色涂片上仅看到游离芽孢的原因：因为该细菌的培养时间过长,已经达到生长的中后期。随着环境中营养物质的消耗以及细菌次级代谢产物的积累，对细菌来说，环境越来越不利于生长，所以必须产生芽孢以度过不良环境。因此也就会产生大量的芽孢，与此同时，芽孢囊也会解体。所以，在实验涂片上，就会出现大量的游离芽孢，而很少看见芽孢囊和营养细胞。3.用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等玻片冷却后再用水冲洗?答：脱色必须等玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。实验小结通过本次试验，掌握了细菌的芽孢染色法，并了解了芽孢的形状、着生位置、芽孢囊等形态特征。加热初染是实验的关键步骤，加热时一定要注意温度不要过高，且要及时增加染液，不要使染液干涸。分析本实验结果不明显的原因主要有以下几点：菌种培养时间较长，老龄菌较多且有些芽孢囊已破裂；加热染色时温度过高甚至出现沸腾，导致菌体或芽孢囊破裂；进行番红复染时时间不够长，使染色不充分。