实验七苯硫脲尝味的群体遗传学调查

实验七苯硫脲尝味的群体遗传学调查一、实验目的1.测定人群中PTC尝味基因的表现型和基因型，理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。2．了解酶切扩增多态序列（又称为PCR-RFLP）技术的原理，学会用PCR-RFLP技术检测单核苷酸多态性（SNPs）。在分子水平上测定PTC尝味的基因型。二、实验原理苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的苯基衍生物，为白色结晶粉末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能团而有苦涩味。能尝出1/750,000-1/50,000PTC浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜味）称为苯硫脲“尝味者”,只能尝出PTC浓度大于1/24,000溶液的味道的人称为苯硫脲“味盲者（nontaster）”。PTC尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状，是由位于7号染色体上的一种苦味味觉感受器基因TAS2R38决定的，属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子(TT)能尝出1／750,000-1／6,000,000的PTC溶液的苦味，杂合子(Tt)只能尝出1／480,000-l／380,000的PTC溶液的苦味。人类的PTC尝味基因又名PTC、T2R38或T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)：一处是145位，味盲者为G145（编码丙氨酸ala），尝味者为C145（编码脯氨酸pro）；第二处是785位，味盲者为T785（编码缬氨酸val），尝味者为C785（编码丙氨酸ala）；第三处在886位，味盲者为A886（编码异亮氨酸ile），尝味者为G886（编码缬氨酸val）。因此味盲者PTC多肽中三处对应的氨基酸分别是ala49、val262和ile262，被称为AVI等位基因，而尝味者的三处是pro49、ala262和val262，被称为PAV等位基因。如图1所示。图1PTC尝味基因上的三个SNP位点味盲者的PTC编码区有五个限制性内切酶Fnu4H1的识别位点（识别序列5’-GC↓NGC3’），如果是尝味者，则其第785位SNP恰好形成了一个额外的Fnu4H1识别位点（GCTGC）。因此可以利用这个SNP造成的限制性位点多态性，设计引物扩增包含785位SNP位点的PTCFnu4H1基因编码区的一部分，然后用Fnu4H1切割扩增产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型（haplotype）。如图2所示。图2味盲者PTC尝味基因编码区序列三、实验用品1．人口腔上皮细胞总DNA、引物Ⅰ和Ⅱ（20μΜ）、TaqDNA聚合酶（5U/μl）、10×PCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、限制性内切酶Fnu4H1（20U/μl）、10×酶切缓冲液。2．2%的琼脂糖凝胶、1×TAE、6×上样缓冲液、DNAMarker、Goldview染料。3．PCR仪、凝胶成像系统、微量加样器（5μl、20μl、200μl）、枪头（20μl、200μl）及离心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机。四、实验步骤1.口腔上皮细胞总DNA的提取（1）每实验小组选取1名受试者，用灭菌牙签刮取口腔上皮细胞。（2）在1.5ml灭菌微量离心管中加入100µL灭菌水。（3）受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来的细胞在灭菌水中漂洗。（4）涡旋振荡器涡旋振荡混匀10s。（5）离心机瞬时离心10s。（6）沸水浴中煮沸5min。（7）离心机13200rpm离心2min。（8）基因组DNA4°C保存备用。2.PCR扩增PTC基因片段，反应体系如下：上游引物：hPTCForward5’-aactggcagaataaagatctcaatttat-3’下游引物：hPTCReverse5’-aacacaaaccatcacccctatttt-3’。按以上次序，将各物质加入到一只无菌的0.2ml离心管中。轻轻混匀后，离心5秒钟，加入一滴液体石蜡盖于反应混合液的表面，然后放入PCR仪中进行循环反应。PCR反应程序如下：94℃5min(预变性)---94℃30s(变性)---55℃30s(退火)---72℃30s(延伸)---step1step2step3step472℃10min(延伸)---4℃保存step5step6其中从step2到step4循环40次，PCR产物总长303bp，反应结束后置4℃冰箱保存。3.PCR产物的Fnu4H1酶切反应体系15μl其成分如下：PCR产物6μlFnu4H1（10U/μl）1μl10X酶切缓冲液2μl无菌水6μl置37℃水浴消化1小时，4℃保存4.琼脂糖凝胶电泳检测（1）胶板的准备取有机玻璃内槽，洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意，将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙）。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。（2）2%的琼脂糖凝胶的制备称取1克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到2%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶贮存液（10mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5μg/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。（3）将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，预电泳10min。（4）每份限制酶切产物取10μl，加2μl6×上样缓冲液，混匀后加入到样品孔中，以100V电泳50分钟。（5）断电后取出凝胶，放在紫外透射仪中观察并记录PCR-RFLP结果。电泳结果中基因型为TT的尝味者能够出现2条酶切条带，基因型为Tt的尝味者能够出现3条酶切条带，基因型为tt的味盲者能够出现1条酶切条带，如图3,4所示。图3不同基因型酶切条带数目图4PCR产物酶切电泳结果五、实验结果与分析观察并记录琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段长度，绘制出不同基因Fnu4H1RFLP等位片段与系谱相关图。