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实验十二食品中蛋白质含量的测定(一)微量凯氏定氮法16090211李亚东一、实验原理蛋白质是复杂的含氮有机物,主要是由碳、氢、氧、氮、硫五种元素组成,由20种氨基酸通过酰胺键(肽键)以一定的方式结合而成。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同,故各种不同的蛋白质其含量也不同,蛋白质中的氮含量一般为15-17.6%,按16%计算,氮换算为蛋白质的系数为6.25。如玉米、荞麦、青豆、高粱、鸡蛋、肉及肉制品为6.25;乳制品为6.38;面粉为5.70;;花生为5.46;大米为5.95;大豆及其制品为5.71;大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83;芝麻、向日葵为5.30。在食品和生物材料中,还包括有非蛋白质氮的化合物,如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、啉和含氮色素等。因此,凯氏定氮法测定蛋白质含量的同时,还包括非蛋白质的含氮部分,故结果称为粗蛋白质含量。样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的有机氮与硫酸结合生成硫酸铵。然后,碱化蒸馏使胺游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以蛋白质换算系数,即为蛋白质含量。称为凯氏定氮法,由于1833年首先提出,经长期改进已演变为常量法、微量法、自动定氮仪法及改良式微量凯氏法等多种。本法是测定食品中蛋白质的标准方法。⑴消化NH2(CH2)COOH+H2SO4→NH2(CH2)OH+H2O+SO2NH2(CH2)OH+2H2SO4→NH3+CO2+2SO4+3H2O2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4⑵蒸馏(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+Na2SO4+2H2O2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O⑶滴定(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3或(NH4)2B4O7+2H2SO4+5H2O→(NH4)2SO4+4H3BO3二、实验试剂所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。1混合催化剂:硫酸铜10g,硫酸钾100g,硒粉0.2g,在碾钵中碾细,过40目筛。2标准硫酸氨溶液:准确称取重结晶的硫酸铵1.414g,溶解并定容为1000mL。3浓硫酸4硼酸溶液(2%):临用前取100mL,滴加约1mL混合指示剂,摇匀后,溶液应该呈酒红色。5氢氧化钠溶液(40%)6混合指示剂:1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合均匀。70.01mol/L盐酸标准溶液(需要标定)三、仪器1(改良式)微量凯氏定氮仪2凯氏烧瓶250mL3酸式微量滴定管10mL四、操作方法(一)消化精密称取0.2~0.4g谷物样品,置于消化管中内,不能沾染瓶颈,加入0.5g混合催化剂及3mL硫酸,在放置于通风橱内的消化炉中小心加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后(该过程大约需要2~3小时),再继续加热0.5h。取下放置冷却后,移入100mL容量瓶中,并用少量水洗凯氏烧瓶,洗掖并入容量瓶中,再加水至刻度,摇匀备用。同时做一空白实验。(二)仪器的安装和样品的蒸馏、吸收与滴定1、微量凯氏定氮仪(1)蒸馏的准备工作凯氏定氮仪的安装:按照图18—1所示顺序将微量凯氏定氮仪的各部件安装好。要求装得稳妥端正。各部件之间以乳胶管相连,不得漏气。吸收瓶的洗涤与检查:用作吸收瓶的三角瓶,一定要洗涤干净。先按一般方法洗净,再按图18—2的方法用蒸气洗涤数分钟,冷却后加入2%硼酸指示剂混合液5.o或10.Omi。若瓶中液体呈紫红色(葡萄紫色),用表面皿盖好瓶口备用。若瓶中液体变绿色,则说明吸收瓶没有洗净,需用蒸气重新洗涤后再用。凯氏定氮仪的洗涤与检查:在烧瓶(蒸气发生器)内装半瓶蒸馏水,再加浓硫酸及混合指示剂各数滴将瓶中蒸馏水酸化。再加沸石少许。打开自由夹9.关闭夹子11,12,冷凝管通进冷却水,然后将烧瓶内水煮沸,此时产生的蒸气可充分地洗涤仪器。约十分钟后,再换上吸收瓶。吸收瓶中加有lOmL硼酸—指示剂混合液,将冷凝管的出口浸没在吸收瓶液面之下。继续冲洗2—3分钟,若吸收瓶内溶液的颜色不变,则表明该仪器被冲洗干净。然后先移去吸收瓶,关闭自由夹9,打开夹子12。此时,由于贮液瓶受到自然冷却,其内部形成负压,反应瓶内的废液,因受到从冷凝管出口传来的大气压力,而自动地流人贮液瓶中。贮液瓶中的废液,再经打开活塞11即可排出。另外在进行冲洗时,还须同时检查仪器的各个连接部位,以免出现漏气现象。蒸馏操作练习:为了熟悉仪器的操作方法,用事先配制好的标准硫酸铵溶液代替样品消化液,反复进行蒸馏、滴定和计算,直至完全熟练,再正式蒸馏试样消化液。在夹子9关闭,12,11打开的情况下,用移液管准确量取5.0mL标准硫酸铵溶液,注入漏斗中。随即打开夹子10,使硫酸铵溶液流入反应瓶中。然后,每次用2mL水共3次冲洗漏斗,也全部放人反应瓶中。在冷凝管出口处放上已盛有10.0mL2%硼酸—指示剂混合液的三角瓶,并使冷凝管出口浸没在吸收液中。用量筒取10~12mL40%氢氧化钠溶液,注入漏斗中。打开夹子10,当碱液快流完时(留碱液约1mL),立即关闭夹子10。此时向漏斗中再注入约2mL水,起封闭作用,以防氨气逸出。上述操作依次完成后,即可打开夹子9,关闭夹子11、12。这时蒸气从烧瓶经过贮液瓶进入反应瓶中,瓶中所加的硫酸铵溶液受热后迅速与碱液起反应,从而有氨气放出。氨气与水蒸气一起通过定氮球进入冷凝管,最终以液滴形式进入吸收瓶,使吸收瓶硼酸液因吸收氨而变色。当吸收液从酒红色变为蓝绿色后,再继续蒸馏2—3分钟为蒸馏完全。这时将吸收瓶向下移,使液面离开冷凝管约1cm,然后用少量蒸馏水冲洗冷凝管出口,最后取下吸收瓶,用表面皿盖好瓶口,准备滴定。每完成一次蒸馏后,对反应瓶就要进行排废液和洗涤。为了保证测定的准确性,每次蒸馏之后,起码要冲洗3次。滴定:用装有0.010mol/L的标准盐酸溶液滴定上述吸收液,直至吸收液呈淡紫红色(淡葡萄紫色)并在半分钟内不褪色为止,记录消耗标准盐酸的体积(m1)。消化液的蒸馏、吸收及滴定:用完成的消化稀释液代替标准硫酸铵溶液依照上述的的操作方法,进行正式蒸馏、吸收和滴定操作。其方法与测定标准硫酸铵溶液时完全相同。2熟悉改良式微量凯氏定氮仪。将自来水经(11)注入到蒸馏瓶夹层(1)中,使水面稍低于蒸馏瓶颈部的转弯处,把装有2%硼酸溶液的接受瓶,置于冷凝器(8)的下方,冷凝器的出口尖端(9)插入酸液面以下,接收瓶内须事先加入指示剂。将样品由漏斗(7)注入到蒸馏瓶(2)中,并以少量水冲洗漏斗,并把氢氧化钠溶液由漏斗(7)注入到蒸馏瓶(2)中,并以少量的蒸馏水冲洗漏斗,然后用少量蒸馏水将漏斗封闭。最后加热,将蒸馏夹层(1)内的水煮沸,从蒸馏瓶(2)内的水溶液沸腾开始计算时间,大约5分钟即可蒸馏完毕,移开接收瓶后,再移去火源以防倒吸。蒸馏瓶的洗涤:当把火源移去后,蒸馏瓶⑶内的废液立即流到蒸馏瓶的夹层(1)中,[用手按住(11)亦即可],并经排水管(14)排出。再把装有蒸馏水的三角瓶置于冷凝器尖端插入水的液面以下,再加热至沸腾,然后移去火源,三角瓶中蒸馏水流到蒸馏瓶(3)内,再倒流至蒸馏瓶的夹层(1)中,再由排水管(17)排出。按照上述方法将仪器洗涤2-3次。3蒸馏向蒸馏瓶内加入10mL2%硼酸溶液及混合指示剂1滴,溶液呈酒红色,使冷凝管(9)下端插入液面下。吸收5.0mL样品消化稀释液,由漏斗(7)入蒸馏瓶接收瓶(2),并用少量水冲洗,再将10mL40%氢氧化钠溶液由漏斗⑷入蒸馏瓶⑶,以少量水洗涤,夹紧螺旋夹,用少量水将漏斗封闭,此时蒸馏瓶中内容物转为深兰色或产生褐色沉淀。开始蒸馏,蒸馏瓶夹层中水加热传导给蒸馏瓶(2)使氨挥发,沿着冷凝管(8)而入接收瓶,至硼酸接受液开始由酒红色变为蓝绿色时起,继续蒸馏约5min,将冷凝管尖端提出液面,再蒸馏1min,然后用水淋洗冷凝管尖端外部,取下接收瓶停止蒸馏。同时做试剂空白试验。4滴定用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至溶液由蓝绿色转为微红色为终点,记录滴定所用盐酸标准体积。五反应式⑴消化NH2(CH2)COOH+H2SO4NH2(CH2)OH+H2O+SO2NH2(CH2)OH+2H2SO4NH3+CO2+2SO4+3H2O2NH3+H2SO4(NH4)2SO4⑵蒸馏(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O⑶滴定(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3或(NH4)2B4O7+2H2SO4+5H2O(NH4)2SO4+4H3BO3六计算(V1-V2)×mol/L×0.014W×5/100式中:X:样品中蛋白质的含量,%;V1:样品消耗盐酸标准溶液的体积,mL;V2:试剂空白消耗盐酸标准液体积,mL;X=×F×100mol/L:盐酸标准液的摩尔浓度;0.014:1摩尔盐酸标准液1相当于氮数;W:样品的质量,;F:氮换算为蛋白质的系数;5/100:稀释比。V1=6.31-1.86=4.45mlV2=0.4mlw=0.5020gX=15.24%分析:奶粉中蛋白质的含量在15%到20%之间,该奶粉是合格的,由于操作人员失误,未将冷凝器出口一直伸入接收瓶的液面下,导致另外一组数据偏小,因此,该组实验数据作废,有效数据只有第二组。六、说明1称样时应注意,不要将试样沾在瓶颈上,固体样品用绘图纸包好投入凯氏烧瓶内,同时空白试验也放入同样大小绘图纸。含水分多的样品或液体样品,应先将水分蒸发掉,然后进行消化。2消化样品时,一般约3-4h左右,消化时间过长会引起损失,若样品含脂肪或糖多时,消化时间会适当长些,应注意防止泡沫溢出瓶外,须时时摇动,并减少火力,必要时可以停止加热30min后,再用大火消化。消化液澄清时应呈蓝绿色。3硫酸钾的加入能提高消化液的沸点,加快样品分解速度,缩短消化时间,但硫酸钾与硫酸的用量比不宜过大,因温度过高生成的硫酸氢铵也会分解放出氨,造成氮的损失,使结果偏低。反应式如下:K2SO4+H2SO4====2KHSO42KHSO4====K2SO4+H2O+SO4但K2SO4加入量不能太大,否则消化体系温度过高,又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。(NH4)2SO4====NH3+(NH4)HSO42(NH4)HSO4====2NH3+2SO3+2H2O4硫酸铜的催化作用机理如下反应式所示:2CuSO4CuSO4+SO2+O2C+2CuSO4Cu2SO4+SO4+CO2Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H2O+SO2此反应不断进行,待有机物全部被消化完后,不再有硫酸亚铜褐色生成,溶液呈现清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外,还可指示消化终点的到达,以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。5蒸馏过程中不得停火断气,否则将发生倒吸。另加碱要足量,操作要迅速,并在漏斗口上水封,防止氨的损失。并不应使碱污染冷凝管及接收瓶,如发现污染,应立即停止蒸馏样品,待清洗干净后再蒸馏样品。冷凝管出口一定要插入吸收液中,防止氨挥发损失,蒸馏结束后,应先将吸收液离开冷凝管口,以免发生倒吸,再撤离火源。6若使用0.2%甲基红醇溶液与0.1%甲基蓝水溶液等体积混合作为指示剂,酸型紫红色,碱型为蓝绿色,变色点为5.4显灰色。7本法是国家标准食品中蛋白质测定方法GB5009.5-85规定方法。
本文标题:实验九食品中蛋白质含量的测定lyd
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