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实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质相对分子质量2015.9.23一、实验目的二、实验原理三、实验步骤本节课的内容一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。二、实验原理电泳的基本知识和原理SDS的性质与作用聚丙烯酰胺凝胶的性质什么是电泳？电泳（electrophoresis）是指带电颗粒在电场中的泳动。许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下带有电荷，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。电泳的基本知识和原理影响带电粒子在电场中泳动的因素1．生物大分子的性质：待分离生物大分子所带电荷的多少、分子大小和性质都会对电泳产生明显影响。2．缓冲液：缓冲液pH值直接影响生物大分子的解离程度和带电性质.溶液pH值距离等电点愈远，生物大分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越快。当缓冲液pH大于等电点时，生物大分子带负电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液pH小于等电点时，生物大分子带正电荷，电泳时向负极移动。电泳的基本知识和原理3．电场强度：电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高。降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物大分子扩散增加，同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度。电泳的基本知识和原理4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。电泳的基本知识和原理5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之则泳动速度慢。电泳的基本知识和原理电泳技术的分类1.根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳：①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉等。2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快，但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500V以下，电位梯度为2～10V/cm。这类电泳的分离速度较慢，但对电泳设备要求简单。电泳的基本知识和原理3．根据电泳系统pH是否连续分为连续pＨ电泳和不连续pＨ电泳：①连续pH电泳是指电泳全过程中pH保持不变，②不连续pH电泳是指电极缓冲液和电泳支持介质中的pH不同，甚至电泳支持介质不同区段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝胶电泳。4．根据工作目的和分离样品的数量多少分为分析电泳和制备电泳。5．根据结合配套的技术种类不同分为免疫电泳、层析电泳、等电聚焦电泳、转移电泳、双相电泳、脉冲梯度电场凝胶电泳和相互垂直交替电场凝胶电泳等。6．根据电泳物质类别不同分为细胞电泳、核酸电泳、蛋白质电泳等电泳的基本知识和原理电泳示踪剂电泳常用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以确保样品均匀沉入加样孔内。电泳的基本知识和原理十二烷基磺酸钠(SDS)SodiumdodecylsulphateCH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+SDS的性质与作用SDS是一种阴离子型去污剂，SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质SDS复合物。蛋白质变性0.1-1%SDS0.1Mbeta-巯基乙醇蛋白质与SDS分子按比例结合1：1.4SDSSDS的性质与作用SDS的结构决定了它可破坏蛋白质的疏水作用（该作用对维持蛋白三级和四级结构相当重要），SDS：十二烷基磺酸钠，十二烷基部分是疏水结构，而磺酸钠部分是亲水或极性结构。SDS的疏水结构可插入蛋白质的疏水内部（通常水溶性的蛋白质，其疏水氨基酸残基埋藏在蛋白内部，亲水氨基酸残基位于分子表面），这样，SDS就破坏了蛋白的疏水作用，从而破坏蛋白的三级或四级结构，引起变性。beta-巯基乙醇SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系SDS的性质与作用丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1～100μg）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析；还可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS）以测定蛋白质亚基的相对分子质量。聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶性质聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的。聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：（1）化学聚合：通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在TEMED催化下，过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合作用。（2）光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素在光照下光解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。故一般采用化学聚合。聚丙烯酰胺凝胶的性质不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。浓缩效应在浓缩胶中进行；电荷效应和分子筛效应在分离胶中进行。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。聚丙烯酰胺凝胶的性质三、实验步骤一、安装垂直板型电泳装置二、凝胶的制备分离胶的制备在一个干净的小烧杯中，按所列的试剂用量配制。SDS-不连续系统12％分离胶浓度，10ml体积配制量：1.30%凝胶贮液4.0ml2.分离胶缓冲液1.25ml3.10%SDS0.1ml4.ddH2O4.0ml5.10%过硫酸胺0.06ml6.2%TEMED0.6ml加入分离胶溶液pH8.8封水或饱和乙醇溶液出现明显界面时，分离胶凝聚完成（３０min~１h）倒出水或乙醇，并用滤纸吸干制备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。浓缩胶的制备在另一个干净的小烧杯中。4.5％分离胶浓度，5ml体积配制用量表：1.30%凝胶贮液0.75mL2.浓缩胶缓冲液0.83mL3.10%SDS0.1ml4.ddH2O3.0mL5.10%过硫酸胺0.03mL6.2%TEMED0.3mL分离胶pH8.8加入浓缩胶溶液pH6.8制备浓缩胶样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。插入样品梳浓缩胶对蛋白样品具有压缩堆积作用。凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选pH6.8的TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。大大提高了电泳的灵敏度。浓缩胶的工作原理：牛血清白蛋白样品2样品1蛋白marker样品1样品2牛血清白蛋白两块胶一个电泳系统，两组共用：第一组加样第二组加样第二块胶加样顺序与第一块胶相同三加样将pH8.3的电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中，应没过短玻璃片。用微量注射器依次在各个样品凹槽内加样，一般加样体积为10～15μL。如样品较稀，可加20～30μL。由于样品溶解液中含有比重较大的甘油，故样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。四电泳将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电流控制在15～20mA,待样品进入分离胶后，改为30～50mA。待蓝色染料迁移至下端约1～1.5cm时，停止电泳，约需1～2小时。恒压(60V---90V)1.加入电极缓冲液pH8.3浓缩胶pH6.83.通电分离胶pH8.82加入样品上样及电泳开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。五剥胶取下凝胶模子，将凝胶片取出，滑入一白瓷盘或大培养皿内。六染色和脱色染色用一块胶，另一块胶用于转膜。加入染色液，染色45分钟。脱色染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。20～30min换一次脱色液，2～3次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清晰。七、Mr的计算标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。=蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）相对迁移率以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。八转膜胶放在3张缓冲液浸湿的滤纸上，盖上经甲醇激活（15-30sec）的PVDF膜（切多余的膜及纸，与凝胶一样大小）排气泡，盖同样3张缓冲液浸湿的滤纸，排气泡。顺序：负极－3层滤纸－凝胶－膜－3层滤纸－正极，如图。用塑料夹夹紧，放入转移电泳仪，电泳槽搁置冰上，恒压１小时。丽春红染色1分钟检测目标蛋白。九封闭PVDF膜用TBST淋洗，放入封闭液中蛋白转膜组装顺序（sandwich制作）组装顺序：转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－膜－滤纸－海绵垫－红色面（正极）海绵Cathode_Anode+滤纸膜胶滤纸海绵醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质【基本原理】本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。【操作步骤】一、准备与点样1．将醋酸纤维薄膜切成2.5cm×8cm的小片。在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻轻划一线，表示点样位置。2．将醋酸纤维薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲溶液面上（缓冲溶液盛于培养皿中），使膜条自然下沉。3．将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出，将薄膜无光泽面向上，平放在干净滤纸上，用干净滤纸吸去薄膜上多余的缓冲溶液。4．将膜条（无光泽面向上）放于一干净滤纸上，用宽1cm的有机玻片在盛有血清的小烧杯中蘸一下，使软片下端粘上薄层血清，然后按在薄膜点样线上，让血清渗入膜内，移开软片。二、电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极（切勿弄错）。槽架上四层滤纸作桥垫，膜