实验二十三小牛胸腺DNA的制备

实验二十三小牛胸腺DNA的制备实验目的1.了解DNA的存在状态，增加感性认识。2.掌握DNA的制备方法以及细胞分级，细胞核制备，细胞膜裂解和解离DNA-蛋白复合体（DNP）的技术。3.学习用紫外分光光度计测定DNA含量的方法。实验原理核酸是重要的生物大分子。在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在。因此，在提取和制备DNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP。提取出DNA-蛋白质复合体（DNP）后，还必须将其中的蛋白质除去，因此，提取纯化DNA要经过以下四个步骤：1.制备细胞核；2.裂解细胞核；3.解离DNA—蛋白质复合体；4.从可溶性物质中分离出DNA。小牛胸腺、猪脾、鱼精子和植物种子的胚胎等生物材料，细胞核含量比例大，因而含有丰富的DNA，是提取DNA的好材料。本实验以小牛胸腺或猪脾为材料。小牛胸腺不仅DNA含最高，而且其脱氧核糖核酸酶（DNase）的活性较低，在制备过程中由此酶所引起的DNA降解损失也较小。为了防止DNase的作用，在用于提取的缓冲液中均含有1mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）螫合剂，以除去保持DNase活性所必须的Mg++离子。为防止DNA的变性和降解，操作要尽可能在低温下进行。本实验通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodiumdodecylsμLfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。提取纯化后的小牛胸腺DNA用紫外分光光度法进行鉴定分析，并计算其收率和纯度。本实验所得的DNA样品将用于实验五的Tm测定。三、器材与试剂器材：1.高速冷冻离心机，50mL塑料离心管，300mL塑料离心管2.食品加工机和高速分散器3.恒温水浴4.磁力搅拌器5.量筒：50mL、250mL、500mL6.烧杯：100mL、500mL、1000mL7.具塞三角瓶：250mL8.小培养皿9.吹风机10.可扫描的紫外分光光度计试剂：a.0.01M柠檬酸钠－9mg/mLNacl－1mmol/LEDTA，pH7.0，300mLb.0.15M柠檬酸纳－1mmol/LEDTA，pH7.0，300mLc.20%SDS（公用）d.氯仿－异戊醇（24:1）混合液500mLe.95%乙醇和无水乙醇f.丙酮g.0.1mol/LNaOH四、实验步骤1.制备细胞核⑴取小牛胸腺（或猪脾）在冰块上去除脂肪和结缔组织，切碎，称10g，放入食品加工机，加入予冷的试剂a.溶液60mL，打碎三次，每次20秒，仃20秒。将打碎后溶液倒入小烧杯，用高速分散器匀浆三次，每次20秒，仃20秒。⑵将匀浆后溶液分装于两个50mL离心管，仔细平衡后，用高速冷冻离心机，4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清（脂肪层等）留沉淀。⑶将沉淀置于小烧杯，加50mL予冷a液，用高速分散器同样再匀浆分散三次，同样4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清留沉淀。⑷取出沉淀加60mL予冷b液，再高速分散二至三次，每次分散10秒，停10秒。2.裂解细胞核将悬浮液移入250mL烧杯中，在磁力搅拌器上边搅拌边滴入8mL20%SDS，应观察到溶液明显变粘稠（报告中回答：为什么？）。用55℃水浴温热10min～15min，然后在搅拌下缓慢加入8～10gNaCl，再搅拌10min，使NaCl全溶，此时应观察到溶液变稀（为什么？）。冷却至室温。3.解离DNA—蛋白质复合体⑴将溶液倒入250mL具塞三角瓶中，加入此溶液二分之一体积的d液（氯仿用于变性蛋白质，异戊醇用于消除泡沫，也可用异丙醇、异丁醇），剧烈振荡10min，倒入300mL离心管中，4℃，10000r/min，离心5～10min，用滴管取出上层水相，中层蛋白质界面弃去，下层有机相倒入回收并。⑵取出的上层水相重复加d液、振荡、离心，至中层界面无混浊为止。4.提取DNA⑴将取出的水相滴入予冷的95%乙醇中，边滴加边用玻璃棒搅拌起白色纤维状DNA沉淀。搅拌速度对产率有影响，若产出减少可补加或换新乙醇。（观察并解释实验现象）（回收乙醇）。⑵搅起的DNA置于已称重的小培养皿内，依次用95%乙醇和无水乙醇清洗纤维状DNA沉淀至无浑浊为止，最后再用丙酮清洗一次，用吹风机将DNA吹干。⑶称重，并计算产率。5.测定DNA⑴准确称取50～100mgDNA，加少量0.1mol/LNaOH溶解，加H2O定容至50mL。⑵用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA的紫外吸收曲线，测定A260和A280，并计算比值：A260/A280，纯DNA的此比值约为1.8。⑶根据：每mL1微g的纯DNA的A260值=0.020，计算所得DNA的纯度，并讨论纯度较低的原因和解决办法。