实验二多管发酵法测定水中大肠菌群总数

第1页共3页实验二多管发酵法测定水中大肠菌群总数一．实验目的和要求1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术。2．巩固细菌学检验法的内容。二．原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（mostprobablenumber），简称MPN表示。三．仪器(1)高压蒸气灭菌器。(2)恒温培养箱、冰箱。(3)生物显微镜、载玻片。(4)酒精灯、镍铬丝接种棒。(5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶。四．测定步骤1．生活饮用水：①初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。②复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。2．水源水①于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL1∶10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。②根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表2“最可能数（MPN）表”，即求得每100mL水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故MPN值再乘以10，即位1L水样中的总大肠菌群数。例如，某水样接种10mL的5管均为阳性；接种1mL的5管中有2管为阳性；接种1∶10的水样1mL的5管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5～2～0，得知100mL水样中的总大肠菌群数为49个，故1L水样中的总大肠菌群数为49×10=490个。对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应做1∶10、1∶100、1∶1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。第2页共3页如果接种的水样量不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值：)()(10mLmLMPNMPN接种量最大的一管指数值附表1大肠菌群检数表接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）10mL水量的阳性管数100mL水量的阳性瓶数0121L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数01234567891033711141822273136404813182430364351606911182738527092120161230230附表2最可能数（MPN）表（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）出现阳性份数每100mL水样中细菌数的最可能数95%可信限值出现阳性份数每100mL水样中细菌数的最可能数95%可信限值10mL管1mL管0.1mL管下限上限10mL管1mL管0.1mL管下限上限0000111112334400120011202300010001010010012224244665171713170.50.50.50.50.50.50.50.50.55535771171115151513464631462222233333555501123001122223101000101001207799128111114144970947911223122441723282517172121281925253434130170220190第3页共3页444444445555551112233400011101201010012012172126222627333423344333466357979911127111511162146637867788093937089110931201505555555555555533344444555555123012340123451101401801301702202803502403505409201600≥2400313744354357901206812018030064025031050030019070085010007501000140032005800五、试验结果计算及分析。