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1绪论教学时数1教学重点植物组织培养的概念及理论依据。教学难点无教学目的要求学生掌握植物组织培养的概念及依据，了解植物组织培养的依据和发展概况。教学方法讲解、讲授法。一．植物组织培养的概念和重要性1．植物组织培养（planttissueculture）：是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过程。根据培养的对象不同，组织培养可分为器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养和原生质体培养等。根据培养过程，将从植物体上分离下来的部分进行第一次培养，称作初代培养（primaryculture），以后将将培养物转移到新的培养基上继续培养，则统称为继代培养（subculture）。根据培养基物理状态，把加入琼脂使培养基呈固态的培养，称固体培养（solidculture）；不加入琼脂而培养基呈流体状态的培养，称液体培养（liquidculture）。2．植物组织培养的优越性：可以在不受植物体其它部分干扰的情况下研究被培养的部分（这部分称为外植体，explant）的生长和分化的规律。3．植物组织培养的特点：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。4．重要性：植物生物技术（又称植物生物工程）是按照人类的意愿有目的地改良植物的一种技术，它是当前世界新技术革命的一个重要组成部分。组织培养是植物生物技术的主要分支之一。组织培养在理论上是研究细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科的重要手段；在生产上在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛应用。可见组织培养无论在理论研究还是生产实践都是十分重要的。二．植物组织培养的理论依据1．植物细胞全能性组织培养的理论依据是植物细胞具有全能性（totipotency），所谓细胞全能性是指植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养情况下，这些信息可以表达，产生出完整植株。要使细胞全能性表达出来，形成完整的植株，除了生长以外，还要经过分化、脱分化和再分化等过程。当将离体组织或器官放在培养基上进行离体培养（invitroculture）时，这些离体组织或2器官就会进行细胞分裂，形成一种高度液泡化的呈无定形状态的簿壁细胞，称为愈伤组织（callus）。由高度分化的植物组织或器官产生愈伤组织的过程，就称为植物细胞的脱分化（dedifferentiation）。将脱分化的愈伤组织转移到适当的培养基上继续培养，这些无定形的愈伤组织又会重新分化出具有根、茎、叶的完整植株----再分化（re-differentiation）。2．离体器官分化途径离体器官的分化方式有许多种，最常见的有三种：一是由分生组织直接分生芽；二是由分生组织形成愈伤组织，经过分化实现细胞的全能性；三是游离细胞或原生质体形成胚状体（embryoid），由胚状体直接重建植株。三．植物组织培养的历史根据细胞学说，德国植物学家Haberlandt于1902年提出细胞全能性概念，认为离体培养的植物细胞具有通过胚胎发生过程而发育成完整植株的潜在能力。White在1939年报道了由烟草种间杂种幼茎切断的形成层组织，进行组织培养获得成功并能继代培养，他提出了植物细胞全能性的学说。20世纪40年代末50年代初。Skoog和崔澄等人进行烟草髓培养诱导根、芽器官，获得成功。1958年美国Steward等和德国Reinert等分别由培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，形成新植株。这从实验上证明植物细胞的全能性。我国的李继侗等曾作银杏离体培养，发现其胚乳提取物能促进离体胚生长。罗士韦是我国植物组织培养和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一。在30年代即开创离体根培养，随着又进行幼胚和茎尖培养。解放后，特别是70年代以后，身体力行，指导植物组织培养技术的推广工作，取得了很大成效。近二三十年，我国植物组织培养研究工作取得了很大成就，特别是在花药培养和单倍体育种上处于世界领先水平。在果树、林业、花卉等方面也取得了很大成功。四．植物组织培养的应用1．无性系快速繁殖；2．花药培养和花粉单倍体育种；3．药用植物的工厂化生产；4．种质的保存和基因库的建立；5．突变体的筛选培育。3第一章实验室设备和一般技术教学时数2教学重点实验室设计和常用器材的使用。教学难点无菌概念和无菌操作。教学目的通过本章教学，让学生对植物组织培养实验室有个初步的认识，明白无菌操作的概念及其在组织培养中的重要性，掌握常用设备和器皿的基本操作。教学方法讲授、图示、参观及操作示范。第一节实验室设计植物组织培养实验室通常包括通用实验室、接种室、恒温培养室、检查培养情况并做记录的细胞学实验室。此外还需有相应的花房和试管苗移栽房等。一．通用实验室主要用于植物组织培养所需器皿的洗涤、干燥和保存，培养基的配制、分装和灭菌，化学试剂的存放及配制，蒸馏水的生产，待培养植物材料的预处理及培养物的常规生理生化分析等操作。二．接种室接种室主要用于植物材料的消毒和接种，培养物的继代转移等等。它是无尘、无对流空气的非常洁净的实验室。要求进入室内的工作人员的衣物、鞋帽、头发、手和脸都要十分清洁，避免带入杂菌造成污染。1．无菌操作室（顺便交代无菌操作概念）无菌操作室最好设有内外两间：外间是缓冲室，内间是无菌操作室，缓冲间可使工作人员进入无菌操作室前有一个过度，以减少将室外杂菌带入无菌操作室。无菌操作室是无菌操作的重要空间，墙壁和地面要光滑，便于清洗和消毒。室内要定期消毒、灭菌。2．接种箱在条件较差的情况下，可考虑自制无菌箱来代替无菌操作室。现一般不常用。3．超净工作台超净工作台一般由鼓风机、滤板、操作台、紫外光灯和照明灯等部分组成。根据风幕形成的方式，可分为垂直式和水平式两种。超净工作台的工作原理是：鼓风机送入的空气经过细菌过滤板除去微生物后，再流过工作台面，并在操作人员和操作台之间形成风障，使杂菌不能进入，形成一个无菌的工作面。4三．培养室培养室是培养试管苗的场所，要满足外植体生长所需的温度、光照、湿度和空气等条件。室内温度通常要求在25℃左右，一般采用空调机来控制。光源通常采用普通40W的白色日光灯，每层培养架安放2~4支日光灯管。有可能的话可考虑增设一个暗培养室，作为那些不需光照的外植体培养场所，如愈伤组织诱导等。培养室的墙壁最好用隔热性能良好的材料，少受外界温度的影响。培养室的湿度应保持在70~80%。此外在培养室内可放置液体培养需用的摇床或旋转床等。四．洗涤室大量生产时应另辟一个洗涤室，装有水槽以清洗用具，地面要耐湿并能排水。灭菌锅、蒸馏水器、干燥箱等可从通用实验室移到本室，方便操作。除上述几种主要房间外，假如条件许可，也可以再建立摄影室、人工气候室、试管苗练苗室等。第二节常用设备和器材一．高压蒸汽灭菌锅1．种类：2．原理3．使用方法4．注意事项二．接种工具常用的有：双筒实体显微镜、镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等。三．培养设备常用的有：空调机、定时器、温度控制器、增湿和去湿机、培养架、摇床或旋转床、日光灯、光照培养箱等。四．化学实验及分析设备天平、酸度计、蒸馏水器、烘箱、电炉、药品柜、冰箱、废污物桶等。五．培养物细胞学观察设备5主要包括显微观察设备、组织切片染色用设备、照相冲洗设备。第三节玻璃器皿的选择与清洗一．玻璃器皿的选择常见的有：试管、三角锥瓶、培养皿、果酱瓶等。二．玻璃器皿的清洗1．洗涤剂：肥皂、洗洁精、洗衣粉和铬酸洗涤剂。一般用洗衣粉即可。2．新购置的玻璃器皿由于它们或多或少含有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸内浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲淋一便，干后备用。3．对已被霉菌等杂菌污染的玻璃器皿则必须现在121℃高压蒸汽灭菌30分钟后再清洗。4．洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。6第二章培养基及其配制教学时数3教学重点培养基成分及其作用、培养基配制程序教学难点培养基配制程序及方法教学目的通过本章教学，使学生掌握培养基配制方法，了解培养基各成分的作用及不同培养基的特点。教学方法讲述、讲授结合实物演示及实验植物组织培养的成功与否，除了培养材料本身的因素外，很大程度上取决于对培养基的选择。培养基的种类、成分等直接影响材料的生长发育，故应根据培养材料的种类和部位，选取适宜的培养基。不同的培养基特点不尽相同，了解和分析它们的特点，既便于选择合适的培养基，又可在组织培养中开发新的培养基。第一节培养基的成分植物组织培养基都是由无机营养物、炭源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。一．无机盐无机盐包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氢、氧、氮、磷、钾、硫、钙、氯、镁。氮通常是指硝态氮或氨态氮，但在培养基中多以KNO3或Ca（NO3）2的硝态氮形式来满足培养物对氮素的需求，或将两种混合使用，有时也以硝态氮为主，补加（NH4）2SO4以满足酸性植物的需要。磷是植物的必须元素之一，参与植物生命活动中核酸、蛋白质合成、光合作用、呼吸作用、及能量的贮存、转化与释放等重要生理生化过程，因此在组织培养物中需大量的磷。钾是主要的阳离子，近年来在培养基中的用量呈逐渐提高的趋势。钙、钠、镁的用量较少。微量元素是指铁、硼、锰、锌、钴、钼、铜等，其需要量很少，一般多为10-5~10-7mol.L-1，稍多则产生毒害。二．炭源和能源植物组织培养中被培养的外植体，由于其光合作用的能力较低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖为最常用，效果也最好。然而在体细胞组织培养中，葡萄糖、麦芽糖和山梨醇也有影响；在花药培养中，麦芽糖也有促进作用。糖类在培养基中除了作为碳源和能源以外，还具有维持培养基一定的渗透压的作用。大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是1%~5%，但个别植物组织培养中蔗糖7的浓度也可高达7%甚至15%，如玉米、油菜等植物的花药培养。一般来说，蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为3：1~3：2，即约有1/4~2/5的蔗糖用于保持培养基的渗透压。三．维生素类维生素类与植物体内各种酶的形成有关。维生素的种类很多，在植物组织培养中通常以B族维生素为主，使用浓度一般为0.1~1.0mg/L，其中以盐酸硫胺素（B1）、盐酸吡哆素（B6）、维生素B12、烟酸、生物素和维生素C最为常用。在各种维生素中，Vit.B1可能是必需的。其它可能只对外植体的生长起促进作用。肌醇本身不促进外植体的生长，但可能有助于活性物质发挥作用，从而促进外植体生长、胚状体及芽的形成。培养基中肌醇的用量为50~100mg/L。四．氨基酸及有机附加物在一些培养基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酰胺（Gln）、天冬酰胺（Asn）等，它们是培养基中重要的有机氮源。甘氨酸能促进离体根的生长，对植物组织培养物的生长也有良好的促进作用，一般用量为2~3mg/L。丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体的形成或不定芽的分化。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用，常用量为500mg/L。酪氨酸可不同程度地替代水解酪蛋白或水解乳蛋白的作用。在某些植物组织培养中还加入一些天然的有机物，例如椰子乳10~20%，酵母提取物0.5%，番茄汁5~10%，香蕉泥100~200mg/L，其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。如培养基中加入100~200mg/L的香蕉泥，具有较大的pH缓冲作用，主要用于兰花的组织培养，对幼苗的发育有较大的促进作用。五．植物生长调节物质生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素最为常用。（一）生长素它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生。生长素常用的是2.4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NA