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实验食品中苯甲酸(或山梨酸)的高效液相色谱法分析(1)实验目的掌握液相色谱法测定食品中苯甲酸含量的原理、色谱分析的参考条件及各项操作。(2)原理样品加温除去二氧化碳和乙醇，调pH值至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱柱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。(3)试剂①优级纯甲醇；稀氨水(1：1)；2％碳酸氢钠溶液；0.02mol／L乙酸铵溶液：称取0.77g乙酸铵，加水至500mL，溶解，经滤膜(0．45μm)过滤。②苯甲酸标准储备溶液准确称取0.1000g苯甲酸，加2％碳酸氢钠溶液5mL，加热溶解，移人100mL容量瓶中，加水定容至100mL，摇匀。此溶液每毫升含苯甲酸lmg。③山梨酸标准储备溶液准确称取0.1000g山梨酸，加2％碳酸氢钠溶液5mL，加热溶解，移人100mL容量瓶中，加水定容至100mL，摇匀。此溶液每毫升含山梨酸为1mg。④苯甲酸、山梨酸混合标准溶液吸取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各10.0mL，置100mL容量瓶中加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1mg/mL，经0.45μm滤膜过滤。⑤苯甲酸、山梨酸混合标准曲线制作分别吸取苯甲酸、山梨酸标准溶液(含苯甲酸、山梨酸分别为0.1mg/mL)2mL,4mL,6mL,8mL于10mL容量瓶中,用纯净水定容,经0.45μm滤膜过滤。(4)仪器设备高效液相色谱仪(带紫外检测器)。(5)操作方法①样品处理汽水：称取5.00—10.0g样品，置小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水(1：1)调pH值约7。加水定容至10-20mL，经0．45μm滤膜过滤。果汁类：称取5.00—10.0g样品，用氨水(1：1)调pH值约7，加水定容至适当体积，离心沉淀，上清液经0．45μm滤膜过滤。配制酒类：称取10.0g样品，放人小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水(1：1)调pH值约7，加水定容至适当体积，经0．45μm滤膜过滤。②高效液相色谱分析参考条件色谱柱：YWG—C184.6mmb×250mm，10μm不锈钢柱；流动相：甲醇—0.02mol／L乙酸铵溶液(5：95)；流速：1mL／min；进样量：l0μL；紫外检测器：230nm；灵敏度：0.2AUFS。根据保留时间定性，外标峰面积法定量。(6)结果计算样品中苯甲酸的含量按下式计算：式中：X——样品中苯甲酸的含量，g/kg；A——进样体积中苯甲酸的质量，mg；V2——进样体积，mL；V1——样品稀释液总体积，mL；m——样品质量，g。(7)方法分析及评价①为了在短时间内提供快速的分离，可选用一种粒径比国家标准推荐方法更小的，5μm的填料的C18柱来分离苯甲酸、山梨酸和糖精钠3种物质。在同样的甲醇比例下，3种物质可以很快地出峰。②被测溶液pH值对测定和色谱柱使用寿命均有影响，pH8或pH2时影响被测组分的保留时间，对仪器有腐蚀作用，应以中性为宜。③测定苯甲酸、山梨酸和糖精钠也可以用MicroPAKCN—104mm×300mm柱，流动相可用甲醇-水。④山梨酸的灵敏波长为254nm，在此波长测苯甲酸、糖精钠灵敏度较低，苯甲酸、糖精钠的灵敏波长为230nm，为照顾3种被测组分灵敏度，方法采用波长为230nm。⑤甲醇和乙酸铵的比例对色谱分离和3种物质的保留时间有影响，甲醇含量越高，3种物质在色谱柱上的保留时间越短，分离时间也越短。本方法甲醇含量为5％时有较好的分离度和合适的保留时间，甲醇与0.02mol／L乙酸铵的比例为5：95。⑥如果柱子长时间未用，平衡时间不充分，会出现糖精钠和山梨酸的峰位置颠倒现象。如果采用二极管阵列检测器的多个波长检测时就会很容易识别，因为山梨酸的灵敏度在254nm比在230nm时明显要高得多，而在230nm时两者有相近的灵敏度，往往不容易发现。⑦本法为GB／T5009.29--2003测定苯甲酸含量的第二法。可用于山梨酸和糖精钠的测定。⑧在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。⑨本法所采用的直接稀释进样，回收率为98.8％—103.5％；若样品前处理采用乙醚提取，回收率为95.4％—98.4％，但两种方法相对偏差小于10％。⑩本方法苯甲酸检出限为2.5mg/kg。⑧本方法推荐的色谱条件分离时间相对较长，不利于常规的实验室分析；同时，国标法中，测定苯甲酸、山梨酸和糖精钠的高效液相色谱法中样品处理只是提到了汽水、果汁和配制酒类，而对于其他的样品处理方法没有提及。