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实验三SDS-PAGE【目的要求】1.了解并掌握SDS-PAGE电泳原理及方法。2.掌握垂直板电泳的操作方法。【实验原理】十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋白质,并可测定蛋白质的相对分子量,其原理主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关。1凝胶的分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶，蛋白质颗粒在电场中通过此凝胶时会受到阻碍。大分子蛋白质受到的阻力大，电泳速度小，而小分子蛋白质受到的阻力小，移动快，因而最终在凝胶中得以分离。2电荷效应：SDS是一种表面活性剂，在蛋白样品和凝胶中加入SDS，则能与蛋白质分子上的疏水基团结合，使蛋白质表面覆盖一层SDS分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差别，使各种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷，分子之间的电荷差异消失。3变性效应：SDS同时还破坏了蛋白质中的非共价键。导致蛋白质变性，使SDS-蛋白质复合物在溶液中呈现相似的形状。因此蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于分子量的大小。在进行SDS-PAGE电泳时，同时使用蛋白质分子量标准样品，则可以在电泳完毕后根据标准分子量大小得知样品蛋白质的相对分子量。4凝胶对样品的浓缩效应：SDS-PAGE使用一种不连续的缓冲系统，即分为低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液的pH值和离子强度也不相同。电泳时，样品中的SDS-蛋白质复合物首先经过浓缩胶，体积得到极大的浓缩，然后再经过分离胶被分离。5.分子量测定原理：在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。【试剂器材】1．30%凝胶贮备液称取30g丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺0.8g，用去离子水配制成100ml的溶液，过滤贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存。2．10%凝胶贮备液称取10g丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺0.5g，用去离子水配制成100ml的溶液，过滤贮存于棕色瓶中4℃冰箱保存。3．10%SDS用去离子水配制，贮存于室温中。4．1%TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）。5．10%过硫酸铵用去离子水在临用前配制。6．Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）：Tris6.0g甘氨酸28.8g10%SDS溶液10ml用蒸馏水定容至1000ml7．1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris181.7g，加适量蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至8.8，加蒸馏水至1000ml（500ml）。8．1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液称取Tris121.1g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至6.8，加蒸馏水至1000ml。（500ml）9．0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液称取Tris6.1g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至8.0，加蒸馏水至1000ml。（只需要100ml）10．2×样品缓冲液：蔗糖4g溴酚蓝2mg10%SDS2ml5%β-巯基乙醇0.5ml0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，2ml用蒸馏水定容至10.0ml11．0.25%考马斯亮蓝R250将2.5g考马斯亮蓝R250溶解于450ml甲醇中，再加入450ml蒸馏水和100ml冰乙酸，混匀过滤除去颗粒物质。12．洗脱液将50ml甲醇和75ml冰乙酸溶解于875ml蒸馏水中混匀。13．预染蛋白质分子量标准:117kD、90kD、49kD、35kD、26kD、19kD共6种蛋白质14．电泳槽、电泳仪、扫描仪、染色缸、摇床、一次性手套、微量加样器等。【操作步骤】1制备凝胶(1)准备玻璃板,洗净、晾干。按电泳槽使用说明装好，按下表配制12%分离胶溶液。浓缩胶和分离胶的配置5%浓缩胶的配置各组分名称各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量1ml2ml3ml4ml5ml6ml8ml蒸馏水0.681.42.12.73.44.15.530%丙烯酰胺0.170.330.50.670.831.01.31.0MTris-HCL0.130.250.380.50.630.751.010%SDS0.010.020.030.040.050.060.0810%过硫酸铵0.010.020.030.040.050.060.08TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.00812%分离胶的配置各组分名称各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量5ml10ml15ml20ml30ml40ml50ml去离子水1.63.330%丙烯酰胺2.04.01.5MTris-HCL1.32.510%SDS0.050.110%过硫酸铵0.050.1TMEMD0.0020.004(2)小心将分离胶注入准备好的玻璃间隙中，并为浓缩胶留有空间。轻轻在顶层加入几毫升去离子水，以阻止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。(3)凝胶聚合后，倒掉上层水，用滤纸吸干凝胶顶端的水。(4)按表3-1配制浓缩胶，注入分离胶上端，插入梳子，应小心避免产生气泡。2点样(1)待测蛋白样品的制备若样品为水溶液，且蛋白质含量大于10mg/ml，可将待测液与样品缓冲液等体积混匀，100℃加热3min。（2）浓缩胶聚合后，拔去梳子，将凝胶放入电泳槽中，在上、下槽中加入电泳缓冲液。（3）将样品混合液、标准蛋白按次序加入梳孔中。3电泳起始电压为8V/cm，当染料进入分离胶后，将电压调至15V/cm，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。4染色取下凝胶，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中，在摇床上室温缓慢摇动30-60min。5脱色换洗脱液，于摇床上室温缓慢摇动1-2小时，其间更换1-2次洗脱液。洗脱后的凝胶可以照像或干燥，也可置于含有20%甘油的水中密闭保存。【注意事项】1SDS-PAGE电泳要求样品的离子强度尽量要低，如果离子强度过高，应经透析或离子交换除盐后再进行电泳。2丙烯酰胺试剂是一种神经毒素，可通过皮肤吸收，会因多次积蓄而中毒。操作时应极其小心，需要带一次性手套。3上样量以10-15μl为宜，如果样品蛋白含量过少，为保证区带清晰，可增加上样量，同时应将样品缓冲液浓度提高二倍或更高。4溴酚蓝染料是指示剂，为电泳时可见的迁移标志物。5凝胶聚合的时间与温度有关，夏天聚合快，可置于冰浴中减慢聚合，冬天室温低，可放入温箱中加快聚合。