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实验五荧光分光光度法测定氨肽碘针剂中色氨酸的含量一、实验目的色氨酸是一种强荧光物质,其激发波长EX=294.0nm，荧光波长EM=353.8nm，在稀溶液中荧光强度与浓度成正比关系。氨肽碘是一种治疗早期老年性白内障，玻璃体混浊等眼病的药物，采用猪全眼球和甲状腺经胰酶和霉菌蛋白酶水解提取的生化试剂，其含有色氨酸、谷氨酸、亮氨酸等15种氨基酸，故可应用荧光法来测定氨肽碘中色氨酸的含量。(注:自己再整理组织一下语言)二、实验原理(注:未完待续：把为什么可以定量分析也写进去)用某些物质分子受光照射时所发生的荧光的特性和强度，进行物质的定性分析或定量分析的方法。当物质分子吸收了特征频率的光子，就由原来的基态能级跃迁至电子激发态的各个不同振动能级。激发态分子经与周围分子撞击而消耗了部分能量，迅速下降至第一电子激发态的最低振动能级，并停留约10－9秒之后，直接以光的形式释放出多余的能量，下降至电子基态的各个不同振动能级，此时所发射的光即是荧光(如图所示)。产生荧光的第一个必要条件是该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构；第二个条件是该分子必须具有一定程度的荧光效率，即荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上，亦即进行扫描，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的图，即为荧光激发光谱。荧光发射光谱的形状与激发光的波长无关。三.试剂及材料1.色氨酸标样(生化试剂)；2.氨肽碘针剂；3F-2500荧光分光光度计；4.容量瓶250ml2只，50ml5只；5.移液管1ml1支。四.操作步骤1.标准溶液配制准确称取0.025g色氨酸标样，配制成250ml溶液，则此溶液浓度为100ppm，分别移取此溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，于50ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，待测定各标准溶液的荧光强度。2.氨肽碘溶液配制准确移取0.2ml氨肽碘针剂于250ml容量瓶中，定容、摇匀后待测。3.荧光强度测定(1)荧光光度计操作开启220V稳压电源至220V；打开主机电源开关。检查氙灯电是否开启。(2)色氨酸激发光谱的绘制，参数设置如下：①设定纵坐标②设定灵敏度；③设定扫描速度；④发射波长EMISSIONWavelength400.0nm；⑤激发波长范围220~350nm；⑥将某一浓度的色氨酸标液置于试样池中，观赏试样池盖子；⑦扫描得到激发光谱。（激发波长为278.0nm）(3)标准溶液及样品的测定，参数设置如下：①设定纵坐标②设定灵敏度；③设定扫描速度；④设定激发波长EXCITIONWavelength278.0nm(从激发光谱曲线中)得到；⑤发射波长范围EMISSIONWavelength300~500nm；⑥将1号标准溶液放入试样池中；⑦扫描得到荧光光谱。仪器开始扫描，得到1号标准溶液的荧光强度。其余各标准溶液和氨肽碘样品只要重复上述⑥⑦操作，就可以分别得到它们的荧光光谱。按各标液的荧光强度做出I-C工作曲线。五.数据记录及计算1.列表样品编号样品浓度(ppm)荧光强度10.420.831.241.652.06未知溶液2.工作曲线的绘制荧光强度-浓度曲线图y=1339.3x+53.358R2=0.9679010020030040050060070080000.10.20.30.40.50.6浓度/ppm荧光强度3.氨肽碘针剂中色氨酸含量计算(以μg/ml计)：色氨酸含量=样品测得的荧光强度所对应的浓度×250×5=（x-53.358）÷1339.3×250×5=g/ml六、实验注意事项1.标准溶液进行测试时溶度应从低到高。2.外壁残液用擦镜纸吸干后方可放入样品池支架内，以保持样品室的洁净3.保持仪器表面的清洁，可用软布擦拭，任何溢出于样品需要马上擦拭干净4.测试结束后应将样品从样品池倒出，样品池洗干净。5.实验结束后，要做好仪器使用情况登记，若有故障，请及时反映。