实验八外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测

实验八外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测（12学时，9小时）Ⅰ外源基因在大肠杆菌中的诱导表达一、实验目的：通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。二、实验原理：将外援基因克隆在含有T7启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacⅠ产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTC（异丙基硫代-β-D-半乳糖）,阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE和（或）活性分析进行检测（本实验Ⅱ、Ⅲ）或做蛋白印迹，用抗体识别表达蛋白。三、仪器、材料和试剂四、实验步骤1.预培养：挑去一含pETBlue-2-AKP表达质粒的单菌落到3ml含50ug\mlCarb、34ug\mlCam和1%葡萄糖的LB液体培养基中，37℃、190r\min振荡培养过夜。2.将过夜培养的菌液1ml接种于100ml含50ug\mlCarb、34ug\mlCam和1%葡萄糖的TM液体培养基中，37℃、250r\min振荡至A6000.6~0.8.3.向其中加入IPTG至终浓度为200ug\l，37℃培养4h。4.6000r\min离心10min，弃上清液。5.收集菌体细胞沉淀，-20℃冻存。（注：为了比较分析应做一个不含目的基因仅含载体的对照菌的表达）Ⅱ活性分析检测表达蛋白一、实验目的：通过本实验了解碱性磷酸酶的活性方法及如何通过活性来监测蛋白的诱导表达。二、实验原理：磷酸酶能水解底物分子上的磷酸集团从而使底物分子脱磷酸化。对硝基酚磷酸为含磷化合物，能被磷酸酶水解为对硝基酚和游离的磷酸集团。对硝基酚磷酸在碱性条件下为无色化合物而对硝基酚则为黄色化合物，在410nm处有光吸收值，利用此反应的颜色变化可以测定磷酸酶的酶活性从而来检测碱性磷酸酶的诱导表达情况。三、仪器、材料和试剂：四、实验步骤：1.向菌体细胞沉淀中加入15mLBufferA,重悬菌体。2.超声破碎:输出功率1200W，超声2s,间隔10s,超声次数40次。3.12000r/min,4℃10min.4.取100μL离心后的上清中加入100μL2×样品处理液，室温保存备用。5.按下表测酶的活性管号1（对照）2（对照菌）3（阳性菌）测活液/μL360360360BufferA/μL4000上清液/μL0404030℃反应10min终止液/μL3.63.63.6A410ⅢSDS-PAGE检测表达蛋白一、实验目的：通过本实验了解和掌握SDS-PAGE检测表达蛋白的基本原理和操作。二、实验原理：SDS是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质拆分成亚单位，并带上阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异，所以SDS-PAGE消除了电荷效应，只有分子筛效应，故蛋白质电泳迁移率完全取决于相对分子质量，迁移率与相对分子质量对数呈线性关系，在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。四、实验步骤：1.配置12%分离胶①把玻璃板放入平板电泳槽中，架好胶板，用封胶条封底。②按如下比例配好分离胶，混匀后立即加入到电泳槽两玻璃板之间，到上口约3cm止，再加一层水，约40min等胶自然凝聚后倾斜倒出蒸馏水，并在两玻璃板夹缝中水平插入1.5mm的梳子（在胶面上加入蒸馏水称为水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入影响凝胶的聚合）。双蒸水分离胶缓冲液30%胶贮液10%SDSTEMED10%AP6.7ml5ml8ml200μL10μL100μL2.配置4%浓缩胶双蒸水浓缩胶缓冲液30%胶贮液10%SDSTEMED10%AP6.1ml2.5ml1.3ml100μL10μL50μL混匀后立即加到分离胶上。聚合后装好电泳缓冲液后小心拔出梳子。2.样品制备：样品与2×上样缓冲液液的1：1混匀，并在100℃水浴中保温3~5min，取出待用。3.上样、电泳：将样品和标准蛋白分别加到样品孔中开始电泳，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，直到溴酚蓝走至前沿为止。4.固定、染色、脱色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶浸泡于染色液染色2h，最后用脱色液脱色至区带清晰为止。五、实验结果：大肠杆菌碱性磷酸酶分子的相对分子质量为47×103，在阳性菌表达蛋白样品中，在此位置有明显条带。六、分析讨论：1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的特性？答:（1）在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；（2）化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶中不溶；（3）对pH和温度变化比较稳定；（4）几乎无吸附和电渗作用；（5）样品不要扩散，用量少，灵敏度高；（6）凝胶孔径可调节；（7）分辨率高，比琼脂糖凝胶电泳分辨率高很多。2、本实验需要掌握哪些知识和技术？答:第一个实验让我们学习诱导表达的原理；第二个实验让我们学习试剂盒的使用方法；第三个实验让我们掌握垂直板电泳的技术。