实验六十二固定化酶制备及酶活力测定

-1-实验六十二固定化酶制备及酶活力测定实验项目性质：综合性所涉及的知识点：酶固定化、酶活测定计划学时：6学时一、实验目的1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。二、实验原理酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法（图1-1-1）等。载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯-马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。-2-图1-1-1酶固定化模式图三、实验用品1.试剂（1）海藻酸钠、3.0％氯化钙；（2）碱性蛋白酶：精确称取干酶粉1克，加入10mLpH10缓冲溶液，在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静止片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL容量瓶中。用缓冲溶液定容至刻度，充分摇匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸取滤液10mL，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液为稀释1000倍的酶液（1.0mg/mL）。（3）福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350mL蒸馏水、25mL85％磷酸及50mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加25g硫酸锂、25mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500mL。过滤，置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍蒸馏水稀释。（4）1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/LNaOH4mL，充分研磨，用蒸馏水洗入100mL容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100mL，保存于冰箱内。（5）pH10缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O)19克，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。乙液：0.2mol/L氢氧化钠溶液。配制pH10硼砂氢氧化钠溶液：吸取甲液50mL，再加入乙液21mL，用蒸馏水定容至200mL。（6）标准酪氨酸溶液：精确称取酪氨酸50mg，加入1mL1mol/L盐酸溶解后用蒸馏水定容至50mL，即得1mg/mL酪氨酸标准溶液。（7）0.4mol/L碳酸钠溶液，0.4mol/L三氯醋酸溶液。2.仪器磁力搅拌器、恒温水浴锅、、注射器、烧杯（100mL，500mL）、布式漏斗、分析天平、-3-容量瓶、移液管、分光光度计；四、实验步骤1.酶的固定化称取1.00g海藻酸钠于盛有30mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20mL。用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200mL3.0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。2.酶活力测定制备酪氨酸标准曲线(1)取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下表）(2)在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40℃水浴中保温15min，取出后，加入0.4mol/L三氯醋酸3mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。(3)分别吸取滤液1mL放入另7支试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15min，然后于每管中各加入3mL蒸馏水，充分摇匀。(4)用721型分光光度计，以0号管作对照，在680nm处测定光密度。(5)以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。表酪氨酸标准曲线制作试管编号酪氨酸含量（μg）1㎎/mL酪氨酸标准溶液（mL）蒸馏水(mL)0123456010020030040050060000.10.20.30.40.50.62.01.91.81.71.61.51.4固定化酶活力测定上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20mL）置于盛有20mLpH10缓冲液的三角瓶中，加20mL1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15min后，取3mL置于试管中，加3mL三氯醋酸溶液。对照管为1mL缓冲液＋1mL蛋白酶液＋3mL三氯醋酸溶液＋1mL1%酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min。摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴保温15min，然后每管各加入3mL蒸馏水，摇匀。用721型分光光度计在波长680nm处，以对照管为对照，测定吸光值。3.结果与计算2.本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：1克碱性蛋白酶粉在pH10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位（U）。-4-3.本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算：每克碱性蛋白酶的活力单位=m/t×fm：样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg）；t：酶促反应的时间（15min）；f：酶的稀释倍数，本实验中f=1000；五、注意事项1.酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40℃以下后再加入酶液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。2.固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠－酶混合物向CaCl2溶液滴加的速度不要过快，混合物要呈颗粒进入CaCl2溶液，以免形成念珠状颗粒。六、思考题1.4种固定化酶方法各自的优缺点是什么？2.酶活力测定过程中应注意哪些问题？