实验六石蜡切片法1

实验六石蜡切片法——包埋、切片和贴片石蜡切片法石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既可制成较薄的切片，使材料各部分都清晰可见，同时也可制成连续切片，观察材料的动态发生及层次，所以，它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握，同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。石蜡切片的主要过程取材——固定保存——冲洗——脱水————透明——石蜡透入——包埋——修块——切片——贴片——复水——染色——脱水——封藏——观察保存（一）包埋（二）修块、切片、贴片（三）染色、封藏一、实验目的掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求；熟练掌握石蜡切片的关键步骤——包埋。学习旋转切片机的使用方法，熟练掌握石蜡切片的关键步骤——切片。二、实验材料及用品实验材料：植物叶片、小鼠肝脏实验用具：载、盖玻片；温箱、包埋盒、水盆等、切片机、毛笔等。实验药品：石蜡、蛋白黏贴剂。三、实验步骤（1）取材（根据制片目的和要求而定，代表性）；杀死和固定：小鼠利用引颈致死法迅速杀死，取其肝脏，用生理盐水冲洗干净后分割成0.5~1cm×0.5~1cm×0.3cm小块投入Bouin’s固定液中进行固定；植物叶片采集后分割成1~1.5c㎡小块后投入FAA固定液中进行固定；冲洗小鼠肝脏经苦味酸固定液固定后必须使用70%或50%AL进行冲洗；植物叶片经FAA固定液后使用流水进行冲洗脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？）50%70%80%95%100%AL100%AL脱水时间：视材料的性质、大小而定小鼠肝脏：在各级AL中停留0.5-1h；植物叶片：在各级AL中停留2-4h；注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水；如需过夜，则停留在70%酒精中。三、实验步骤（2）透明（置换，作用？）常用透明剂：二甲苯；透明原则：低浓度到高浓度（½二甲苯+½100%酒精二甲苯二甲苯）透明时间：小鼠肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留1-3h。脱水不净，用二甲苯透明后，将发生下列不良后果：（1）材料：材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。（2）切片：切片内留有微量水分，在封片以后，就会发生乳白色的云雾状，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，切片就作废了。浸蜡：要点：使石蜡完全浸入细胞的每个部分，同时要使石蜡紧密地贴在细胞壁的内外，成为不可分离的状态；原则：低温高温、低浓度高浓度三、实验步骤（3）包埋：就是将已经浸好蜡的材料连用熔化的石蜡一起倒入定形的纸盒中，使之凝固。包埋前折纸盒包埋时将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速且轻轻地用温镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。然后轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢平放于水盆的水面上，待蜡盒内的石蜡表面凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使冷水从一边浸入纸盒，并立即使它沉如水中，使盒中包埋块迅速凝固，待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。包埋过程中易出现的问题及解决办法问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出薄的切片。原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。三、实验步骤（4）修块：削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm～0.3mm；修块的目的：1）使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲；2）每个切片组织的距离接近，便于镜检或作连续切片。要求：组织块必须①上下平行，②但左右的蜡、上下的蜡不要太多或太少；③正方形或长方形，可各切去一角，以便识别。三、实验步骤（5）切片：用锋利的刀片，将包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片，一般用专门的切片机和切片刀。切片机的结构：控制切片厚薄的微动装置；供装切片刀的夹刀部分；供装置组织块的夹物部分。切片机的类型根据结构分为：滑行式切片机：夹刀部分是滑动的，而夹物部分是固定的，可上下升降；旋转式切片机：夹物部分式上下移动，前后推进，而夹刀部分则固定不变。三、实验步骤（6）切片的步骤：将已经修整好的蜡块装在样品固定器上，并固定好；将切片刀安装在切片机的刀架上，调节切片刀的角度为15°左右，并固定好；调节切片的厚度：棉花叶片：8-10um；小鼠肝脏：6-9um；调节蜡块与刀口的距离：打开刀架固定钮，推动刀架，使切片刀刃贴近蜡块表面（从侧面观察），再固定刀架；切片：打开停刀轧，开始切片，右手握住手轮柄，顺时针方向摇动，每摇动一圈就切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时就连在一起，连续摇转手轮就可以讲切下的蜡片练成一条蜡带。待蜡带有一定长度，左手执毛笔，将蜡带抬起，边摇边移动蜡带。待蜡带长至20-30cm，停止摇动，用右手执另一支毛笔顺刀口方向拔下蜡带，平放于白纸上，靠刀面较光滑面向下，较皱褶的一面向上。切片注意事项：操作时一定要小心，随时注意关好停刀轧，以防刀夹突然下降伤及手指，在换蜡块时，必须先关停刀轧，才能取下蜡块；切片时不要对着蜡带讲话，要防风，以免将蜡带吹散；根据材料要求，注意调节合适的切片厚度；切片完毕后，将刀取下擦净，放入盒内保存，同时用毛笔清洁切片机各部分，将刀架、夹物器等退回原处固定。切片过程中出现问题的一般原因和补救办法：一、蜡带弯曲不直原因：1.蜡块上下两边不平行，或与刀口不平行；2.刀口锋利不一，局部产生差异；3.材料未居蜡块正中央。补救办法：1.取下台木，将蜡块两边修平，调节夹物部，使两者平行。2.移动刀片，改用新刀口。3.用刀片切去部分石蜡，使材料居中。二、切片分离，不能连成带状或卷起成圆筒状。原因：1.室温过低。2.石蜡过硬。3.材料边缘留蜡太少。4.刀的角度不合适。补救办法：1.在切片机上安一盏电灯加温。2.用手指在蜡块面上磨擦。3.重新包埋。4.矫正刀的角度。三、切片粘附于刀片上，皱褶在一起。原因：1.室温过高。2.石蜡过软。3.刀口上留有一层石蜡。4.刀口钝。补救办法：1.在早晚凉爽时切。2.将蜡块投入凉水中稍浸。3.用二甲苯拭去石蜡。4.磨刀或移动刀口。切片过程中出现问题的一般原因和补救办法：四、切片纵裂横波。厚薄不均匀。原因：1.刀口有缺口；2.石蜡块中有颗粒及杂质；3.刀口有细纤丝或碎屑；4.刀和台木未夹紧；5.组织块太硬。补救办法：1.可移动刀片；2.将颗粒挑去；3.清洁刀口；4.旋紧螺旋；5.在水中浸泡。五、材料出现裂隙、破碎或脱落。原因：1.脱水不干净；2.透明剂残留；3.石蜡透入时温度过高；4.材料太硬或太粗。补救办法：1.无法补救；2.重新包埋；3.无法补救；如由于脱水剂，透明剂引起的可改用正丁醇，松油醇等进行脱水和透明；4.软化组织。三、实验步骤（7）贴片：要求：1）贴附牢固，在染色时不易脱落；2）使皱褶的蜡片伸展平整步骤：1）在载玻片上涂上蛋白黏贴剂；2）将已经涂好蛋白黏贴剂的载玻片放在纸面上，并滴加数滴蒸馏水；3）用刀片将蜡带切成许多小段，每段的长度应依照盖玻片的长度为准，一般应比盖玻片短约1/5-2/5，因蜡片加温后要伸长1/5-2/5，在分段时应从蜡片的交界处分开；4）用毛笔将蜡片轻轻移到载玻片上（必须注意蜡片的光面朝下）；5）将载玻片平行地放置在酒精灯的上方，微热，使切片伸展摊平，如发现散开，请重新用镊子排列整齐；6）晾干待用。四、实验结果包埋后的石蜡快应为均匀的半透明状，蜡块中没有气泡。包埋材料摆放的位置是否符合要求？修块效果：每个蜡边与材料平行，蜡边的上下左右摇平行。切片效果：得到厚薄均匀的蜡带，蜡带无破损。展片效果：展片后蜡带或蜡片平整，无气泡、粘附牢固，蜡带略呈透明状，后续制片不易脱落。五、作业实验完毕，每人交包埋块一个，在纸盒上写上材料名称及自己的姓名和日期；实验完毕，每人交玻片两张，用铅笔在载玻片上写上材料名称及自己的姓名和日期；实验报告（姓名和日期）。苦味酸液（波茵氏液）甲液：1％铬酸50ml10％醋酸20ml乙液：甲醛25ml苦味酸饱和水溶液75ml是常用的良好固定液，广泛应用于一般动物组织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫，以及胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物的雌配子体和被子植物的胚囊的固定。此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，不使组织变硬变脆，着色良好。一般动物组织固定12—24h，小块组织数小时即可。固定后直接入70％酒精中洗去黄色，但留一点黄色对染色并无妨碍。植物材料的固定时间为12—48h。甲醛－醋酸－酒精液(FAA)50%或70％酒精90ml冰醋酸5ml甲醛5ml特点：过去称”标准固定液“或”万能固定液“；是组织形态中常用的固定液；同时兼作保存液。是植物制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此液固定．也通用于昆虫和甲壳类的固定。