实验十四过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾标定法)

实验十四过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾标定法）一、实验目的过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。通过本实验使同学们了解过氧化氢酶的作用，掌握其测定方法并比较不同植物或同一植物不同生理状态下过氧化氢酶活性的大小。二、实验原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。三、主要仪器、试剂、材料（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1.研钵；2.三角瓶；3.酸式滴定管；4.恒温水浴；5.容量瓶。（三）试剂：1.10%H2SO4；2.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液；3.0.1mol/L高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L草酸溶液标定；4.0.1mol/LH2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/LKMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。四、实验步骤、现象及记录（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol/LH2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。用0.1mol/LKMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×VT/(W×VS×1.7×t)式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）；t反应时间（min）；1.71ml0.1mol/LKMnO4相当于1.7mgH2O2。