实验四原生质体的分离效率体积和表面积测定.

张群生科楼[e-mail]实验11、原生质体的分离效率、体积和表面积的测定1、掌握原生质的分离和提纯技术；2、原生质体积和表面积的测定；3、分离效率的测定（目视法和荧光双醋酸酯法）实验目的：实验原理•原生质体的研究是近年来在生物学中比较活跃的领域之一。•原生质体（Protoplast）一词的使用始自Hanstein(1880),是指：•“用质壁分离能够和细胞壁分开的那部分物质组成了一个原生质体”•或“除去了全部细胞壁的细胞”，•“一个为质膜所包围的裸露细胞”。•原生质体的分离和提纯是植物生理学、细胞生物学中的一项基本技术。•利用制备的原生质体可进行离体培养、全能性表达、细胞壁再生、质膜特性，以及各种细胞操作（如原生体融合）、遗传操作（如外源基因的导入）等，广泛应用于抗性生理、病性生理和细胞融合等领域。•早期分离制备原生质体采用机械法。其缺点是：（1）手续繁多，得率少；（2）材料局限于具有较大液泡的细胞或长形细胞的组织，如叶片、球茎的鳞片，果实表皮等。•直到1960年，Cocking试用酶解法制备番茄原生质体首次获得成功。•其原理是细胞壁的组成物质主要有纤维素、半纤维素和果胶等，利用纤维素酶和果胶酶等在一定的条件下可将细胞壁的组成物质分解掉，使得原生质体游离出来。图1、利用酶解法获得的蚕豆叶片细胞原生质体ARoot×400BLeaf×400图2大豆幼苗根和叶片原生质体的分离和纯化实验材料•未经抗寒锻炼的小麦幼苗•抗寒锻炼的小麦幼苗。仪器与药品•光学显微镜、培养箱、血球计数板、计数器、物镜和目镜测微尺、小摇床、离心机、酸度计。•纤维素酶、果胶酶、山梨醇、KCl、CaCl2、山梨醇、金钢砂。实验步骤（1）酶液配制：根据酶液用量，用冰冷的含5mmol/LKCl、5mmol/LCaCl2、0.6mol/L山梨醇等渗溶液配制含1.5%纤维素酶、0.5%果胶酶的溶液（用于分离未经锻炼的植物组织，经锻炼的植物组织用0.9mol/L山梨醇等渗溶液配制），搅拌溶解，用1NHCl调pH至5.5,1500g离心10分钟，上清液（酶液）冷贮备用。等渗溶液（适用于锻炼和非锻炼材料2种）酶液（适用于锻炼和非锻炼材料2种）原生体的分离：（1）取小麦叶片（挑大者），去除尖端和基部后（中段）称取0.5克；（2）置于培养皿中加入少量金钢砂，用毛刷刷去表皮角质层，经自来水冲洗后用滤纸吸干，叶面呈均匀水渍状即可；（3）用锋利剪刀或刀片将其制成2mm长的小段，放入100ml烧杯中加入10ml酶液；（4）置于33-35C的培养箱内的小摇床上（约30-40rpm）培养3h,或静置培养5h左右；（5）混合物经双层纱布过滤，以去除组织的残余物，用500rpm离心3-5min,小心果断弃去上清液；（6）小心悬浮沉淀物，加相应等渗溶液5ml稀释；（7）再离心一次，去上清液，小心悬浮，用等渗溶液定容至一定体积(0.2-0.5ml,具体视原生质体数量而定）。计数和测定分离效率：◆熟悉血球计数板的使用和计数方法，按下列要求进行计数：（a)洗净、凉干计数板；(b)上板均匀；(c)以绿、亮、圆形的原生质体为有活力的；(d)同区域计数要设重复（10个左右）。◆因而可计算出每克鲜重叶片所分离出的原生质体数(单位：个/gFW)。血球计数板的总体积为：0.3（长）0.3（宽）0.01（厚）=0.0009(cm3)原生质体表面积（SA）和体积（V）的测定•目镜和物镜测微尺的校正（?…m/格目镜）；•离体原生质体在等渗溶液中呈圆球形;•计数要设重复（10个左右）•悬浮于等渗溶液中的原生质体的表面积和体积，可通过在高倍光学显微镜下用目镜和物镜测微尺测量其直径(D)而求得。为了便于在冰冻过程中对植物细胞的脱水情况和原生体失去渗透反应能力进行定量的研究。SA=4（D/2）2V=[4(D/2)3]/3图3物镜测微尺示意图4目镜测微尺示意图5目、物镜测微尺校准示意（举例）提纯：•可采用离心洗涤法和漂浮法两种方法。•离心洗涤法就是重复（二）中离心、弃上清、悬浮沉淀、加等渗液再离心、再弃上清和悬浮沉淀的过程，镜检直至满意为止。其优点是省事，但缺点是比原生质体重的杂质（如金钢砂）去不掉。•漂浮法：加4ml左右17%蔗糖溶液（用于未经锻炼的植物材料，锻炼材料用23%的蔗糖溶液）于离心管中，再用弯头吸管缓慢加入等体积的0.6mol/L山梨醇溶液（用于未经锻炼的植物材料，锻炼材料用0.9mol/L山梨醇溶液）,使两溶液间建立界面层，用弯头吸管把1/3总体积的原生质体悬浮液缓慢加至界面层上，经离心（500rpm）3-5min后，取出界面层部分，即为纯化的原生质体。用相应等渗山梨醇溶液洗二次，并镜检之。该方法的优点是得到的原生质纯度较高，但缺点是损失较多。图6漂浮法示意离心（500rpm,水平转头更佳）