实验四细菌的芽孢染色

实验四细菌的芽孢染色生物112周泓兆1102040226一、目的学习并掌握细菌芽孢染色的原理及方法。二、原理芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。芽孢具有厚而致密的壁，因此想要将芽孢染色需要在较高的温度（煮沸）的条件下，用强染色剂（孔雀绿）将菌体和芽孢同时染色。而同时，实验利用了孔雀绿可经水洗脱色的特点，通过水洗将菌体的着色洗脱，而芽孢因具有致密的壁而不会被水将染色洗脱。接下来用番红染色，将菌体染为红色，而在常温下品红无法将芽孢着色，因此在显微镜下形成了芽孢为绿色而菌体为红色的现象。而实验中如果要观察芽孢在菌体中的着生位置，一定要根据各菌的特点来确定培养时间。三、材料1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），26℃-28℃，培养2-3天。2.染色剂：孔雀绿染液，番红染液。3.其它：载玻片，无菌水，洗瓶，酒精棉球，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种环，酒精灯，镊子。四、实验步骤1.制片：将枯草芽孢杆菌涂片并干燥固定。2.染色：撕取一块比载玻片略窄的吸水纸，覆盖在涂片出，在吸水纸上滴加孔雀绿直至饱和。用酒精灯加热是染液保持微沸，其间不断添加适量孔雀绿染液，保持吸水纸湿润，染色5min。3.水洗：待玻片冷却后，用镊子出去吸水纸，再用水瓶轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。4.复染：用番红染液染色1-2分钟，水洗。5.镜检：涂片干燥后，滴加香柏油置于油镜下观察。6.清理：用二甲苯与干净擦镜纸擦净镜头，将涂片放入废片缸，将固体垃圾放入垃圾桶，液体垃圾倒入废液缸，无腐蚀性毒性液体可倒入下水道，用酒精棉球擦洗器材将溅出的染料擦除。五、结果与讨论：这个实验成功率很高，主要原因是步骤简单，染色效果明显而且影响因素少，洗脱时间对结果影响要比革兰氏染色中酒精脱色时间的影响小很多。最后结果的小遗憾是孔雀绿绿色的着色较浅，我觉得可以通过适当增加涂片的菌体密度和增加染液煮沸时间，可能会获得更好地效果。六、思考题：1.为什么在孔雀绿加热染色时，要待玻片冷却后才能冲洗？答：我推测的原因如下：①菌体在突然遇冷之后会变形甚至破裂，影响观察。②在沸腾的情况下染料能更方便地进入芽孢，那么高温下染料也应该更容易从芽孢中被洗出，所以等到冷却使得孔雀绿尽可能留在芽孢内。③防止载玻片在高温下突然遇冷而炸裂。2.分别从菌龄、制片等方面，简述细菌芽孢染色需要注意的技术要领。答：应当选取适宜菌龄的细菌来制作做涂片，菌龄过小还没有形成芽孢，菌龄过大则会有好多菌体破裂无法看到芽孢的着生位置；制片过程中则需要注意染色时间的控制，不可过长（使得染色过深无法用水脱色影响观察）或过短（使得染色过浅无法观察到芽孢），还要控制温度不能过高，免得菌体、芽孢囊破裂或染液在载玻片大量沉积影响观察。最后要在冷却后用水冲洗，不能直接用水冲洗热的载玻片。