实验四超氧化物歧化酶测定

高级植物生理实验报告植物抗性生理农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛含量的测定（操作步骤）1试剂配制1.1磷酸缓冲液(PBS)配制药品名称称量(g)母液取母液量(ml)配成磷酸缓冲液(PBS)mlmol/L合并配成稀释1倍NaH2PO41.201000.1851000ml0.10mol/LpH7.82000ml0.05mol/LpH7.8Na2HPO414.2010000.1915注：配成PBS2000ml，其中1000ml用于A液配制，另1000ml用于酶液制备。1.2其它溶液配制代号溶液名称配制浓度称取药品量(g)稀释或定容配成量/每样品用量(ml/ml)用于A蛋氨酸(Met)缓冲液15mmol/LMet2.2383加1000mlpH7.8,0.1mol/L的PBS1000/2SOD活性测定B乙二胺四乙酸(EDTA)溶液0.003mmol/LEDTA0.0877(1)加100ml热蒸馏水(2)再稀释1000倍1000/0.1SOD活性测定C核黄素(VB2)溶液0.1mmol/LVB20.0038100ml蒸馏水100/0.1SOD活性测定D蓝四氮唑(NBT)溶液0.1mmol/LNBT0.08181000ml蒸馏水1000/2SOD活性测定E三氯乙酸(TCA)溶液10%TCA1001000ml蒸馏水1000(用于F液的配制)丙二醛(MDA)含量测定F硫代巴比妥酸（TBA）溶液0.5%TBA51000ml10%的E液1000/2丙二醛(MDA)含量测定2酶液制备称取植物材料１g，加少许0.05mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨，最终定容制得10ml匀浆。转移至10ml离心试管中，在3000rpm下粗离心１分钟，粗提液再转移至2个5ml离心管中，在冷冻离心机13000g、４℃下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD活性和丙二醛含量的测定。3丙二醛含量测定吸取酶液２ml→加入Ｆ液２ml→沸水浴加热15分钟(呈粉红色)→快速冷却→4000rpm下离心５分钟。若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需增加离心力。以Ｆ液为参比液，分别在532nm和600nm处测定光密度值。丙二醛含量（nmol·g-1）＝W1vVR155.0ODOD600532式中：V/v---提取液总量(10ml)／测定液用量(2ml)R---反应液总量(４ml)Ｗ---植物材料鲜重或干重(g)0.155---丙二醛的摩尔浓度消光系数(当[MDA]=1nmol/ml时,OD532-OD600=0.155)[即(OD532—OD600)/0.155的单位为1nmolMDA/ml]室温下处理的叶片在523nm出的光密度值次数12345678910平均值OD523-0.006-0.007-0.011-0.012-0.0030.0230.025-0.016-0.0030.012-0.0022室温下处理的叶片在600nm出的光密度值次数12345678910平均值OD600-0.027-0.054-0.054-0.027-0.042-0.027-0.043-0.042-0.042-0.027-0.039室温下丙二醛含量（nmol·g-1）=W1vVR155.0ODOD600532=-0.0022+0.039/0.155×4×10/2×1=4.75nmol·g-1冷处理下的叶片在523nm出的光密度值次数1234567平均值OD5230.0780.0770.0770.0760.0780.0760.0760.077室温下处理的叶片在600nm出的光密度值次数1234567平均值OD6000.0250.0260.0260.0270.0270.0260.0260.026冷处理下丙二醛含量（nmol·g-1）=W1vVR155.0ODOD600532=0.077-0.026/0.155×4×10/2×1=6.58nmol·g-14超氧化物歧化酶活性测定4.1操作及说明(1)按照下表加入各种溶液：处理重复试管编号按顺序加入各种溶液（ml）光密度(560nm)A液B液C液D液水酶液对照植株(处理1)ⅠⅡ12220.10.10.10.122-0.10.1ODOD胁迫植株(处理2)ⅠⅡ34220.10.10.10.122-0.10.1ODOD仪器调零液520.10.1-20.1*OD0无酶液(NBT还原100%)620.10.120.1-ODmax*仪器调零液中的“酶液”0.1ml，可以取对照植株的，也可以取胁迫植株的。(2)将试管置于阳光下反应15分钟（NBT还原产物为蓝色），然后在560nm下测定光密度(OD560)。(3)若样品反应后蓝色很浅或无，则须减少酶液用量后，再重复上表步骤；若样品反应后蓝色极深或与无酶液同，则须增加酶液用量后，再重复上表步骤。4.2计算1个酶活单位ODOD5.0vODumaxmax定义:SOD抑制NBT还原50%时的酶液用量(ml)。SOD活性(u/g)＝WuV式中：u---1个酶活单位(ml)V---提取液总量(10ml)v---测定酶液用量(0.1ml)Ｗ---植物材料鲜重或干重(g)5问题与讨论5.1在自然光照下，蓝色几乎立即生成，至15分钟时基本稳定。但随照光时间延长，酶会失活，蓝色渐退。故照光时间以15分钟为好，不宜再长。5.2光质、光强、时间、温度、试管质地等因素均对结果产生影响，应尽量保持一致。5.3酶液用量应使处于合适范围之内，否则须加调整（见4.1(3)）。5.4酶液在反应液中所占比重较小，对OD影响也小。但如果浑浊、有色，则需考虑其影响。实验2游离脯氨酸含量的测定（茚三酮法）（操作步骤）1药品配制1.12.5%的酸性茚三酮试剂：称取2.5g茚三酮→加入60ml冰醋酸→加入40ml6mol／L的磷酸→加热溶解→冷却贮于棕瓶中备用。（85％的浓磷酸约为14.6mol／L）。1.23%磺基水杨酸：称取3g磺基水杨酸，溶于100ml蒸馏水中。2标准曲线绘制称取0.025g脯氨酸，定容于500ml蒸馏水中，配成浓度为50μg／ml的脯氨酸母液。按下表绘制标准曲线：用微量取样器取母液(μl)０100200300400500用微量取样器取水(μl)1000900800700600500配成1mlPro标准液浓度(μg/ml)0510152025加入冰醋酸（ml）111111加入茚三酮(ml)222222加入水杨酸(ml)111111显色液Pro浓度(μg／ml)012345在沸水浴中加热显色50分钟→冷却至室温→测定ＯＤ５２０光密度(ＯＤ５２０)，以水为参比液3游离脯氨酸测定3.1提取：称取0.5g植物材料→剪碎后放入试管中→加6ml3%磺基水杨酸→在沸水浴中提取10分钟→3000rpm离心5分钟。上清液为脯氨酸提取液。3.2测定：提取液１ml→冰醋酸１ml→茚三酮２ml→水１ml→沸水浴中加热显色50分钟→冷却至室温→比色测定ＯＤ５２０(以蒸馏水为参比液)→查标准曲线得样品中Pro浓度。4计算脯氨酸含量(μg／g)＝WvVVC21式中：Ｃ---样品比色液的脯氨酸浓度(μg／ml)，由基于脯氨酸显色浓度的标准曲线查得。Ｖ1---样品研磨或煮沸提取液总量(本实验中6ml)Ｖ2---显色反应液(本实验中５ml)v---样品测定汲取液(本实验中１ml)Ｗ---植物材料重量(g)温室处理下ＯＤ５２０次数12345678910平均值ＯＤ５２０0.0360.3700.3520.3500.3500.3630.3730.3620.3620.373脯氨酸含量(μg／g)＝WvVVC21=C×6×5/1×0.5冷处理下ＯＤ５２０次数12345678910平均值ＯＤ５２０0.8580.8580.8690.8580.8440.8580.8460.8590.8580.8580.857脯氨酸含量(μg／g)＝WvVVC21=C×6×5/1×0.55问题讨论5.1若植物材料加热显色后溶液浑浊，可用4ml甲苯萃取，然后比色(标准曲线也相同)。5.2植物样品取样量应视脯氨酸含量而定，并根据经验进行调整，使样品OD位于标准曲线范围之内。5.3公式中没有包含萃取液量(4ml)。若样品测定与标准曲线不同，则必须在计算公式中予以相应表示。实验3过氧化物酶活性的测定（比色法）一、原理过氧化物酶广泛分布于植物各组织中。过氧化物酶与植物的呼吸作用、光合作用以及生长发育密切相关。在H2O2存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成的棕红色产物可用比色法予以测定。O-CH3O-CH34-O–CH3+4H2O2=-O-O--O-O-O-CH3O-CH34邻甲氧基苯酚+4H2O2＝4-邻甲氧基苯酚(棕色)(愈创木酚)(过氧化氢)（测定波长470nm）二、仪器药品1、仪器：分光光度计、离心机、计时秒表2、药品：愈创木酚(4邻甲氧基苯酚)30%过氧化氢20mmol／LKH2PO4100mmol／L磷酸缓冲液，pH6.03、反应混合液配制：100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）＋28μl愈创木酚＋19μl30%过氧化氢配成液贮于棕瓶中在冰箱中保存。三、操作步骤1、酶液制备：称取植物材料1g，加入20mmol/LKH2PO42ml，研磨匀浆，转移至离心管中，再加入3mlKH2PO4冲洗研钵一并转入离心管。以4000rpm离心10分钟。上清液即为过氧化物酶制备液，贮藏于冰箱冷藏室中备用。2、试剂加入：取2支小试管，按下表加入各试剂：试管加入溶液（ml）编号性质反应混合液KH2PO4酶制备液1调零液0322样品液30**此2ml酶制备液必须在仪器调整好之后进行！3、仪器调节：将分光光度计波长调节至470nm；将上表中的调零液倒入比色杯中，放入仪器中，调节仪器零点和100%。4、酶液加入、计时和读数：吸取酶制备液2ml，加入到2号试管中，立即摇匀并同时开启秒表计时，然后迅速将试管中溶液倒入比色杯中并放入仪器中。读取30-180秒钟之间的光密度值，每30秒钟读取1次。实验结果统计3.1丙二醛含量测定丙二醛含量计算公式：室温下丙二醛含量（nmol·g-1）=W1vVR155.0ODOD600532如下表所示：冷冻过程会使植物体内的丙二醛含量迅速上升，植物体内的丙二醛含量和植物的抗寒性密切相关表1丙二醛含量3.2超氧化物歧化酶活性测定如图所示，外界条件变化时无论冷处理或者热处理过氧化物歧化酶的活性都会降低，冷处理和热处理与对照之间均存在显著性差异，冷处理热处理之间不存在显著性差。从结果不难看出外界条件不适宜植物生长时，植物体内超氧化物歧化酶活性会降低。DO平均值丙二醛含量（nmol/g）室温600-0.0394.75B室温523-0.0022冷冻6000.0266.58A冷冻5230.0770.781A0.2315B0.242B00.20.40.60.811.2CK冷处理热处理酶活性（u/g）图1不同处理的过氧化物歧化酶活性3.3过氧化物酶活性测定过氧化物酶活性以单位样品重量每分钟吸光度变化率表示，即：测定时间（s）样品溶液的吸光度（O.D.）样品Ⅰ样品Ⅱ样品Ⅲ样品Ⅳ300.1750.1590.1760.160600.2300.2310.2030.203900.2440.2720.2730.2451200.1480.1620.2170.2001500.1600.2030.1730.4101800.3980.3980.4360.425