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实验二微生物的染色技术一、实验目的与要求1.学习油镜的使用保养方法。2.学习细菌的涂片和简单染色技术。3.学习细菌的革兰氏染色的原理和方法。二、实验原理细菌个体很小，在高倍镜下也看不清楚，需放大一千倍以上才能观察其形态，故要使用油镜头观察。油镜头是在使用时，在物镜与标本之间加一种折射率与玻璃折射率几乎相等的香柏油作为介质，以达到所需的放大倍数。细菌细胞小而透明，含水量较高，在油镜下观察细胞几乎与背景无反差，所以观察细菌的形态结构，必须对它们进行染色，以便于刚观察。因细菌的蛋白质等电点较低，其生长在碱性和中性溶液中细胞带负电荷，所以通常用碱性染料（如美兰、结晶紫、复红、孔雀绿）使其细胞着色。革兰氏染色法可将细菌氏分别革兰氏阳性菌（G＋）和革兰氏阴性菌（G－－）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。革兰氏染色是使用几种不同的染料对细菌进行染色。先进草酸结晶紫初染，次经碘液媒染，再用95%酒精脱色处理，最后用蕃红液复染。如果细菌能保持结晶紫—碘复合物的颜色而不被酒精脱色，则菌体呈兰紫色，为革兰氏阳性菌。如果细菌体内的结晶紫—碘复合物的颜色被酒精脱去，而复染上蕃红的颜色，则菌体呈红色，为革兰氏阴性菌。此染色法之所以能将细菌区为G＋和G－两类，是由于这两类菌的细胞壁成分不同所决定的。G－菌的细胞壁较薄，含有的脂类物质较高，肽聚糖的含量较低，酒精处理时溶解了脂类物质，使细胞壁穿孔，通透性增大，在水洗时将细胞内原有的结晶紫—碘复合物冲走而脱色，再用蕃红复染就被染成了红色。G＋菌由于细胞壁厚，其中含有肽聚糖的量高，脂类含量低，用酒精处理时，使细胞壁脱水，肽聚糖层的孔眼缩小，通透性降低，结晶紫—碘复合物被色在细胞内，而不会在水洗时被冲走，所以在复染时蕃红染液进不去，菌体最终仍呈兰紫色。三、实验材料和器材1、菌种：枯草杆菌斜面菌种、大肠杆菌斜面菌种均为培养18-24小时。2、培养基及试剂：营养琼脂培养基、二甲苯、95％乙醇、苯酚、琼脂粉、香柏油、吕氏美兰染色液、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球等四、实验操作步骤一）简单染色操作步骤：1.涂片：于干净的载玻片中央滴一小滴无菌水，在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌与无菌水充分混匀，涂成极薄的菌膜。（菌要挑少些，涂片要薄些，否则不易观察）2.干燥：涂片后置室温自然干燥。3.固定：手持载玻片的一端，有菌膜的一面朝上，通过酒精灯火焰上方3～4次。（用手背皮肤接触涂片反面，以不烫手为宜）以使细菌粘附在载玻片上更牢固。4.染色：于菌膜上滴加吕氏美兰染液（以盖满菌膜为准），染色1～2分钟。5.水洗：倾去染色液，用洗瓶中的蒸馏水自玻片的一端轻轻冲洗，直至流下的水无色为止（切勿使水直冲菌膜处。）6.干燥：自然干燥或用滤纸轻轻盖在菌膜部位以吸去水份（切勿擦去菌体）。7.镜检：先在低倍镜下找到菌斑后，转动物镜转换器，再于菌斑处滴1滴香柏油，再将油镜头轻轻移下与载玻片接触。然后用目镜观察。此时镜筒仅仅稍微移动，看到菌斑后，在稍微调节细螺旋，即可看到细菌的形态。8.油镜头的清洁：观察完毕后，取下油镜头，先用擦镜纸擦去香柏油，在用滴有二甲苯的擦镜纸擦净镜头，最后用干净的擦镜纸再擦净镜头。收好显微镜入箱即可。二）革兰氏染色操作步骤：1．制片：取二块干净的载玻片，在其中内各加一小滴蒸馏水，以无菌操作规程分别挑取大肠杆菌和枯草杆菌少量，涂布于对应的载玻片上与水混匀，涂成极薄的菌膜。自然干燥后再通过酒精灯进行热固定。2．初染：于菌膜上滴加结晶紫染液，以盖满菌膜为宜，染色1～2分钟后倾去染液，用蒸馏水轻轻冲洗至流下无色为止，甩去载玻片上的残余水。3．媒染：滴加碘液染色1～2分钟，用蒸馏水冲洗干净。4．脱色：滴加95%酒精液脱色30秒钟（准确计时），用蒸馏水冲洗干净。5．复染：滴加蕃红液染色1～2分钟，用蒸馏水冲洗干净最后自然干燥。6．镜检：五、实验结果记录1.绘出你所观察到细菌简单染色的细菌形态图（并注明放大倍数）。2.镜检：在显微镜油镜头下观察大肠杆菌被染成色，枯草杆菌被染成色。3．结论：大肠杆菌属于革兰氏菌，枯草杆菌属于革兰氏菌。六、实验结果分析及问题讨论