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2015研3班406521815156骆德强实验设计作业题目预设：（1）A药物具有在心肌细胞缺血再灌注损伤中的作用（2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变研究目的：（3）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系（4）在A药物保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中背景资料1：心肌缺血，是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。心脏的供血不是一成不变的，而是始终存在着波动，但这种波动经过机体自身调节，促使血液供需相对恒定，保证心脏正常工作。如果任何一种原因引起心肌缺血，经机体调节不能满足心脏工作需要，这就构成了真正意义上的心肌缺血。心肌缺血对心脏和全身都可能带来许多不利影响。氧是心肌细胞活动必不可少的物质，而氧是通过血液输送给细胞的。心脏没有“氧仓库”，完全依赖心肌血供，所以一旦缺血，立刻会引起缺氧。缺氧的直接后果是心肌细胞有氧代谢减弱，产能减小，使心脏活动时必需的能量供应不足，引起心绞痛、心律失常、心功能下降。同时，代谢的废物也不能被有效及时地清除，易产生不利影响。缺氧会导致炎症、凋亡、氧化，最终会影响心脏的收缩功能。若有20％～25％的心肌停止收缩，通常会出现左室功能衰竭；若有40％以上的心肌不能收缩，就会有重度心泵功能衰竭。如果这种情况突然发生，就会出现非常危险的心源性休克。急性心肌梗死就常与这种情况相关心肌缺血还会损害舒张功能。收缩不良和舒张不良结合起来，易导致心室充盈压升高，引起肺充血，还可引起复杂的物质代谢紊乱和心肌电活动失常。总结：心肌缺血导致的主要后果是心肌缺氧。背景资料2：异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌缺血动物模型广泛用于心肌缺血研究和药效评价。具体建模方法见实验设计。题目分析：（1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系：B基因表达产物为B蛋白，因此可以使用免疫细胞化学法来显示B蛋白。具体细节详见免疫组化操作方法。心肌细胞缺血模型与正常模型的差别可能有两种情况，一种是B蛋白增多，另一种是B蛋白减少。（2）A药物发挥作用时候B基因是否参与其中：参与其中有两种含义，第一种是A药物导致B基因表达发生改变，第二种是A药物和B基因共同作用，但是二者没有因果关系。区别二者仅需通过对照实验即可证实。结果猜想：1.心肌缺血导致B基因活化，B蛋白增多：（1）B蛋白会降低心肌细胞对氧气依赖，使心肌细胞对能量的需求得到一定程度的补偿，比如B蛋白是促进心肌无氧呼吸的蛋白。（2）B蛋白是心肌正常工作需要的蛋白，与心肌功能密切相关。由于缺氧使得B蛋白功能下降，为了维持心肌的功能，发生代偿反应，使得B蛋白增多，来弥补B蛋白的功能降低。2.心肌缺血导致B基因活性降低，B蛋白减少：B蛋白是心肌正常工作需要的蛋白，与心肌功能密切相关。由于缺氧使得B蛋白功能下降，而B蛋白功能下降直接导致心肌功能下降。3.A药物的作用：（1）为心肌提供一定的氧气。（2）为心肌直接提供能量。（3）与B基因有关。实验设计：一、动物疾病建模（1）试剂：盐酸异丙肾上腺素注射液（2）实验动物：雄性大鼠（3）步骤：大鼠预先适应2周后开始实验,大鼠随机平均分成2组:（a）正常对照组。12只大鼠每天皮下注射生理盐水,连续10天;（b）模型组。24只大鼠每天皮下注射ISO(2mg·kg−1),连续10天。分别于注射ISO5天后、10天后,即实验开始第6天(采样点1,造模5天)、第11天(采样点2,造模10天),以及第16天(采样点3,模型恢复5天)、20天(采样点4,模型恢复9天)早晨采样。（c）药物组。在模型组中从第六天注射ISO开始取小鼠注射药物。其他采样同模型组。时间/天（a）正常对照组（b）模型组（c）药物组1生理盐水共12只ISO共12只ISO共9只…生理盐水ISOISO6生理盐水ISO取出3只实验ISO取3只加药物…生理盐水ISOISO10生理盐水ISOISO11取出3只实验取3只加药物…16取出3只实验取3只加药物…20取出最后3只实验（每次加药后当天取出小鼠做实验）采样：将心脏整个取出，剪碎获得心肌细胞。多次取样目的是为了获得不同程度的心肌缺血细胞。如果不同程度的细胞经比较结果相同则更有说服力。以下所说的各组小鼠都指代每次取样的小鼠心肌细胞。由于取样多次，则比较时也同样比较多次。二、B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系如果前两次采样中，对照组的B蛋白表达产物都少于实验组，则心肌缺血导致B基因活化，B蛋白增多：仍需进一步实验来验证为猜想1（1）或者1（2）。取正常对照组和模型组小鼠进行无氧呼吸产物检测（乳酸），若检测到含量相差不大，则否定该猜想。若含量相差大，则可以进一步证明1（1）：将B基因剪切并整合到细菌中，若该细菌无氧呼吸强度与正常细菌相比变大，则证明1（1）。否则该假设不成立。另取小鼠实验。敲除小鼠B基因，则小鼠无B蛋白生成。将小鼠正常培养，不添加任何其他试剂。如果观察到小鼠有明显的心肌缺血症状，则说明1（2）得到验证，B蛋白是小鼠心肌细胞正常工作所需，缺少后即表现出心肌缺血症状。否则否定1（2）。如果前两次采样中，对照组的B蛋白表达产物都多于实验组，则心肌缺血导致B基因活性降低，B蛋白减少：说明B蛋白是心肌正常工作需要的蛋白，与心肌功能密切相关。由于缺氧使得B蛋白功能下降，而B蛋白功能下降直接导致心肌功能下降。三、在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中1.同一天取出的模型组和药物组小鼠心肌细胞进行比较，如果二者B蛋白含量相近，则说明A药物不是通过改变B基因活性生效的，B基因表达产物不是使用A药物的结果。但是B蛋白单独参与保护心肌。2.如果模型组和药物组比较，模型组B蛋白含量高，说明B基因表达产物不是使用A药物的结果。但是B蛋白单独参与保护心肌。B蛋白减少可能是由于A药物的使用使得B蛋白并非那么必要。3.如果模型组和药物组比较，药物组B蛋白含量高，则再取正常组加药物。如果仍测得B蛋白含量变高，则说明B蛋白是A药物的产物。