家禽新城疫HAHI的免疫监测

实验二家禽具血凝性病毒病的免疫监测一、实验目的1.掌握血凝性病毒病免疫监测的基本方法。2.学会根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群血凝性病毒病免疫接种。二、实验内容1.红细胞凝集试验－检测抗原的HA效价及4个血凝单位抗原的配制。2.红细胞凝集抑制试验－检测免疫禽只的HI抗体。3.根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群相应病毒病的免疫接种。三、实验仪器、设备及材料1.抗原原液：购自标准厂家，根据监测抗体的种类而确定抗原的种类。ND免疫监测―ND抗原；AIH5免疫监测―H5抗原；AIH9免疫监测―H9抗原；EDS－76免疫监测―EDS抗原。2.被检血清：随机采取被检禽群的血液（抽样比例约为1％～2％，或每个禽群抽取20～40只），取血液自然凝固后析出的血清作为被检血清。3.灭菌PBS生理盐水，PH7.0，按常规配制。4.红细胞悬浮液：采取健康公禽（被检测血清为鸡血清时，应采用公鸡，被检血清为鸭、鹅血清时，应采用公鸭）血液（每次可采5～10mL），抗凝，加灭菌PBS生理盐水离心洗涤3～5次（每次离心的速度和时间为3000转/分钟，15分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，将沉淀的红细胞用灭菌PBS生理盐水稀释成1％悬浮液。该红细胞悬浮液在4℃存放，可用3～5天。注意悬浮液颜色变暗应予弃去。5.其他材料：25uL移液器，96孔V型反应板，普通离心机等。（以下内容主要以ND的免疫监测为例，同学们可依此类推探讨其他血凝性病毒病免疫监测的相关技术）四、实验原理鸡群ND免疫后，体内可产生抗ND中和抗体及红细胞凝集抑制抗体（HI抗体）。后者在体外可抑制NDV凝集红细胞的能力。在一系列试管中，将被检鸡血清作连续稀释，血清中HI抗体越高，则能使ND病毒凝集红细胞能力完全抑制的血清稀释度就越高。由于HI抗体与中和抗体的消长是基本一致的，故通过HI抗体水平的检测可以达到ND免疫监测的目的。五、实验步骤(一)红细胞凝集试验（微量法检测ND抗原原液HA效价及配制4个血凝单位ND抗原）1.分装生理盐水：用移液器在96孔V型反应板的一排孔上的1—12孔，每孔加入PBS生理盐水25uL，换滴头；2.添加抗原：吸取标准ND抗原原液25uL加入第1孔，换滴头；3.稀释抗原：用25uL移液器将第1孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第2孔；用移液器将第2孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第3孔．．．．．．，如此，直至第11孔，从11孔吸取25uL溶液弃去，换滴头；4.加入PBS生理盐水：向1-12孔加入PBS生理盐水，每孔25uL；5.加入红细胞悬浮液：向1-12孔加入红细胞悬浮液，每孔25uL；6.静置感作20-30分钟，然后判定结果；7.判定结果（观察、判定、记录反应结果的相关概念与方法）①“凝集”的概念：观察反应孔，当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“凝集”（将反应板倾斜，无红细胞流淌现象），记录为“+”。②“不凝集”的概念：观察反应孔，当红细胞完全自然沉降到孔底中央，形成一个边缘光滑无凝集颗粒的红圆点，判定为“不凝集”（将反应板倾斜，有红细胞流淌现象），记录为“—”。③ND抗原的血凝效价的概念：凡能使鸡红细胞完全凝集的抗原最高稀释度称为该ND抗原的血凝效价。④判定、记录反应结果的方法判定、记录反应结果时，可绘制一个表格，将试验情况与结果判断作填写。如下是一个ND抗原原血凝效价测定结果判定与记录的例子，可作模仿。孔号123456789101112效价抗原稀析1：24816326412825651210242048PBS对照1：64反应图像●●●●●●⊙⊙⊙⊙⊙⊙结果记录++++++------8．4个血凝单位（4HAU）抗原的配制方法依据ND抗原原液的HA效价，用PBS生理盐水将该抗原原液稀析为4HAU抗原（用于下述HI试验）。每mL抗原原液加入PBS生理盐水的毫升数为：该抗原原液效价的倒数除以4减1。如上例，抗原原液效价为1：64，则，每mL抗原原液加入PBS生理盐水的毫升数为64/4-1=15。（二）红细胞凝集抑制试验（微量法）－检测免疫禽只的HI抗体。1．分装PBS生理盐水：在96孔反应板上，取其12孔，第1-11孔每孔加入PBS生理盐水25uL;2.向第1孔加入被检血清；3.稀释被检血清:用25uL移液器将第1孔中的被检血清与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第2孔；用移液器将第2孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第3孔．．．．．．，如此，直至第10孔，从10孔吸取25uL溶液弃去，换滴头；4.加入4HAU抗原：向第1至第11孔加入4HAUND抗原溶液，每孔25uL;5．加入红细胞悬液：向第1至第12孔加入1％鸡红细胞悬浮液，每孔25uL，室温中静置20～30分钟，观察结果并记录。6.判定结果（观察、判定、记录反应结果的相关概念与方法）①“凝集”的概念：观察反应孔，当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“凝集”（将反应板倾斜，无红细胞流淌现象），记录为“+”，读作凝集。②“完全抑制”的概念：观察反应孔，当红细胞完全不凝集而自然沉降于试管底部中央，形成一个边缘光滑的红圆点，边缘没有分布红细胞凝集颗粒，判定为完全抑制，记录为“－”，读作完全抑制；③被检血清HI效价的概念：凡能使0.25mL浓度4个凝集单位的ND抗原凝集红细胞的能力完全抑制的血清最高稀释度称为该被检血清的HI效价。④判定、记录反应结果的方法判定、记录反应结果时，可绘制一个表格，将试验情况与结果判断作填写。如下是2个被检血清HA效价测定结果判定与记录的例子，可作模仿。孔号123456789101112效价血清稀析度1：2481632641282565121024抗原对照PBS对照1：256血清1反应图像⊙⊙⊙⊙⊙⊙⊙⊙●●●⊙结果记录--------+++-血清2反应图像⊙⊙⊙⊙⊙⊙●●●●●⊙1：64结果------+++++-记录（三）根据ND等血凝性病毒病免监结果指导鸡群相应病毒病免疫接种的步骤1．计算禽群ND抗体合格率禽群ND抗体合格率的计算公式：ND抗体合格率=（被检血清样品数-抗体效价低于临界滴度*的样品数）/被检血清样品数ⅹ100%。*注：ND抗体效价临界滴度：鸡群可抵抗NDV感染的ND抗体的最低滴度。这是一个由生产实际总结得出的数值，可因实际情况的变化而变化。目前，此值通常定为1：32。2.确定禽群抗体合格率的标准禽群抗体合格率的标准也是一个由生产实际总结得出的数值，而且鸡的日龄不同其标准有不同。目前各种日龄鸡群能够抵抗ND感染的的抗体合格率参考标准为：1月龄以下的小鸡，抗体合格率要求在85％以上，且其余15％的被检鸡只的抗体水平不低于1:5；中成鸡群的抗体合格率应在95％以上，且其余5％的被检鸡只的抗体水平应不低于1:5。3．将被检鸡群抗体合格率对照禽群抗体合格率的标准，确定被检鸡群目前的免疫状况，指导其进一步的免疫接种。如下为根据ND等血凝性病毒病免监结果指导鸡群相应病毒病免疫接种的一个例子：某后备种鸡群，18周龄，共3000只种鸡，随机采血20份，经NDHI试验检测，各样品抗体水平情况如下表。请根据该免监结果，对该指导鸡群的ND免疫接种作指导。抗体效价1:81:161:321:641:1281:2561:3201:640监测只数13316600解：1．计算鸡群ND抗体合格率（临界滴度取1：32）：鸡群ND抗体合格率＝（被检血清样品数-抗体效价低于临界滴度*的样品数）/被检血清样品数ⅹ100%＝（20-4）/20×100%＝80%2.确定禽群抗体合格率的标准：本鸡群为中成鸡群，中成鸡群的抗体合格率标准为95％以上，且其余5％的被检鸡只的抗体水平应不低于1:5。3.将被检鸡群抗体合格率对照禽群抗体合格率标准，确定被检鸡群目前的免疫状况：该被检鸡群的ND抗体合格率为80%，而中成鸡群的抗体合格率标准是95%，故可见该鸡群目前ND免疫状况未及格，建议尽快给于ND疫苗的加强免疫接种。六、实验报告要求1.扼要反映本实验步骤。2.报告实验结果应包括各被检血清样品各孔的反应结果和各被检血清的HI效价，及应用本试验结果指导被检鸡群的ND临床免疫接种。3.试指出应用本技术对不同的血凝性病毒病作免疫监测时，在材料、方法上有何异同。七、实验的注意事项(参阅实验步骤)八、思考题家禽具血凝性病毒病的免疫监测技术有哪些关键点?请作扼要陈述。实验二家禽具有血凝性病毒病的免疫监测（以ND为例，兼顾各种病免疫监测技术的特点）一、实验目的1.掌握ND等家禽血凝性病毒病免疫监测的基本方法。2.学会根据ND免疫检测的结果指导禽群的ND等血凝性病毒病免疫接种。二、实验内容1.红细胞凝集试验――检测抗原的HA效价。2.红细胞凝集抑制试验－－检测免疫禽只的HI抗体。三、实验仪器、设备及材料1.抗原：购自标准厂家，根据监测抗体的种类而确定抗原的种类。ND免疫监测――ND抗原；鸽瘟（禽PMV-Ⅰ）免疫监测－PMV-Ⅰ抗原；AIH5免疫监测――H5抗原；AIH9免疫监测――H9抗原；EDS－76免疫监测――EDS抗原。2.被检血清：随机采取被检禽群的血液（抽样比例约为1％～2％，或每禽群抽取20～40只），取其自然析出的血清作为被检血清。3.1％红细胞悬浮液：采取健康公禽血液（每次可采5～10mL），采血后抗凝，加生理盐水离心洗涤3～5次（每次离心的速度和时间为3000转/分钟，15分钟，将血浆、白细胞等充分洗去），将沉淀的红细胞用生理盐水稀释成1％悬浮液，这种红细胞液在4℃存放，可用3～5天。注意悬浮液颜色变暗应予弃去。红细胞来源，检测鸡血清――鸡红细胞，检测鸭、鹅血清――鸭红细胞。4.灭菌生理盐水：pH7.0～7.2。5.移液器（规格分别为0.1mL、0.4mL、0.5mL、1mL），20孔反应板（每孔的体积为1mL），10mL注射器、玻璃铅笔、剪刀、镊子等。四、实验原理鸡群经ND免疫后，体内可产生抗ND中和抗体及红细胞凝集抑制抗体（HI抗体）。后者在体外可抑制NDV凝集红细胞的能力。在一系列试管中，将被检鸡血清作连续稀释，血清中HI抗体越高，则能使ND病毒凝集红细胞能力完全抑制的血清稀释度就越高。由于HI抗体与中和抗体的消长是基本一致的，故通过HI抗体水平的检测可以达到ND免疫监测的目的。五、实验步骤1.全量法测定抗原原液的血凝效价（红细胞凝集试验，HA试验）1.1操作方法在20孔反应板上，取其10孔，第1孔加入灭菌生理盐水0.9mL，第2～10孔各加入0.5mL。用0.1mL移液器吸取ND抗原原液0.1mL加入第1孔中，用0.5mL移液器将第1孔内抗原与生理盐水充分吹打均匀，吸取0.5mL至第2孔，吹打均匀，再吸取0.5mL至第3孔……如此依次倍倍稀释，至第9孔，由第9孔吸出0.5mL弃去。第10孔不加抗原，只加生理盐水作对照。这样，各孔ND抗原原液的稀释度依次为1∶10，1∶20，1∶40……1∶2560。然后向各孔加入1％红细胞悬浮液0.5mL，静置20～30分钟，于第10～15分钟开始观察，一直观察到30分钟，判定并记录抗原原液的HA效价。具体术式见表3－1。1.2结果判定与记录方法1.2.1判定结果的方法：当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“完全凝集”，记录为“#”。当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于孔底3/4面积时，称不完全凝集，记录为“+++”；依次类推为“++”、“+”，均为不完全凝集，这时孔底中央会形成一个小红圆点，是未凝集的红细胞自然沉降集中于孔底中央。当红细胞完全自然沉降到孔底中央，形成一个边缘光滑无凝集颗粒的红圆点，判定为完全不凝集，记录为“—”。结果判定与记录如表3－1。1.2.2判定ND抗原的血凝效价：凡能使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度称为该ND抗原的血凝效价，如表3－1，其ND抗原的血凝集效价为1∶640。其含义是该ND抗原原液作640倍稀释，每0.5mL有一个血凝单位，即每0.5mL抗原原液含有640个血凝单位的抗原。表2—1红细胞凝集试验术式与