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实验一密度梯度离心法提取叶绿体[实验项目]密度梯度离心法提取叶绿体[实验目的]掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。[实验原理]不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。用不同浓度的蔗糖制成浓度梯度，在离心条件下，叶绿体和比他沉降系数小的细胞组分会聚集中到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分则沉淀到离心管底部，这样可粗略的分离叶绿体。[实验仪器设备]超速冷冻离心机（BECKMANL8-60MR）一台荧光显微镜（(Olympus，FX-35WA，Japan)）一台组织捣碎机一台[实验材料]新鲜菠菜叶片[实验药品]匀浆介质(0.25mol/L蔗糖，0.05mol/LTris-HCl缓冲液pH7.4)；称取88.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约4.25ml0.1mol/LHCl，最后定容至1000ml。60%蔗糖溶液，50%蔗糖溶液，40%蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液。[实验内容]1、洗净菠菜叶片，沥干水分，去除叶柄、主脉，称取50g，剪碎。2、加入预冷到0℃的匀浆介质200ml，用组织捣碎机高档捣碎2min。3、捣碎液双层纱布过滤到烧杯中。4、滤液500r/min离心5min，轻取上清液。5、在Polyallomer离心管内一次加入50%和15%蔗糖溶液（或依次加入60%，40%，20%，15%蔗糖溶液），注意要用滴管吸取15%蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50%蔗糖液面，一般两种溶液各加12ml（四个梯度各加6ml），加液完成后，可见两种溶液接口处折光稍有不同，这样密度梯度便制好了。6、在制好的密度梯度上小心的沿着管壁加入3ml粗离心过的上清液。7、严格平衡离心管，分量不足加入少许上清液。8、用甩平转头离心（18000r/min）90min。9、取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴于载玻片，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。[实验数据记录及处理]图1蔗糖密度梯度离心后叶绿体分离图从离心机中取出离心管，观察到离心管内有一层绿色带，用四种蔗糖浓度制成梯度的管内区带出现位置比用两种蔗糖浓度制成梯度的管内位置略低于。图2荧光显微镜检测叶绿体荧光显微镜在470~490nm波长的激发光下可看到视野中有大量红色椭圆形物体，应该为叶绿体。[实验结论]通过蔗糖密度梯度离心可粗略的分离得到叶绿体。[实验注意事项]1.细胞破碎时,不必过细，减少破碎叶绿体的产生。过滤时不要用力挤压,以避免对叶绿体被膜的破碎。2.制备梯度时,蔗糖颗粒在不同浓度梯度中的扩散是不可避免的。低温条件下由于溶液的黏度增加,使扩散变慢,但同时蔗糖的溶解也会变慢,浓度高时溶解得更加缓慢。覆盖时,用宽口枪头吸取,沿管壁轻轻释放。制好的梯度如果不马上使用,则放于冰上,或者放入冰箱内暂时存放。此外,使用高纯度的蔗糖更加有利于保持梯度的稳定。这可能是由于高纯度蔗糖所含杂质离子较少,溶液扩散较慢的缘故。3.加样时一定要小心,防止破坏梯度。为此,应采用宽口吸头吸取叶绿体粗提物悬浮液,释放时,将枪头贴于管壁接近液面上沿处缓慢释放。4.离心时,为防止速度快速上升和快速下降对浓度梯度层的破坏,离心机的加速一定要缓慢,而下降时也要缓慢停下。此外,为防止高速离心过程中温度上升可能造成的由于颗粒扩散而引起的梯度破坏,离心前一定要让离心机在充分预冷。计算好准确离心时间，因为某些型号的离心机在离心起始或到达一定转速，会有抽真空时间。5.为防止光合作用形成的淀粉颗粒在离心时破坏叶绿体,在提取叶绿体前,先将植物材料暗置过夜。[讨论]离心，就是在离心立场的作用下(通常在液态环境中)，不同组分由于迁移率不同，经过一定的离心时间后，彼此分开，或者直接沉底，方便收集。密度梯度离心(densitygradientcentrifugation)是指待离心的组分在离心力场中迁移时，经过的介质（也就是离心管中的适合样品分离的缓冲液）密度不均一，通常是沿着离心力方向线性增大。当待离心的组分迁移到和它密度相等的介质层时，便处于平衡状态，不再迁移。最终形成样品层。通常，密度梯度离心为了分离金属颗粒物，生物大分子，亚细胞组分等。所需的离心机几乎都是超速离心机。密度梯度制作分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。其中氯化绝CsCl，其密度可达1.7g/cm3，用它制成密度梯度可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质(简单白质不适用)。转头的选择：甩平转头是1951年由Kahler(德国)发明得离心转头，适用于低、高、超速离心。细长离心管用于R-z离心可以获得较高纯度和高分辨率，且容易控制离心时间，壁部入在很少。25000rpm-30000rpm的甩平转头最适用于亚细胞器的离心分离，而40000-42000rpm的甩平转头适合用于核酸、蛋白、病毒草类物质内流的分离。离心时间较长。甩平转头用于等密度离心内优缺点分析：甩平转头：用作等密度离心时，壁部效应对分离效果影响较少，梯度变换在甩平时自然过渡因而很适合做等密度离心实验，优点是回收率高，分辨能力强。缺点是沉降距离长，最高转速较低（由于结构层固此类转头最主转速一般在60000rpm以下）因而，离心时间很长，对某些长离心管，10-15ml容量的转头最高转速在40000-41000rpm，用作自形成CsCl梯度的质粒DNA离心往往需要50-70小时。因此可通过适当提高转速来缩短离心时间。在本实验中，1号管中密度梯度从下到上依次为：60%50%40%15%；2号管中密度梯度从下到上依次为：60%15%。在1号管中离心后样品组织集中在离管底约1/4处，所以组织密度约在1.2296-1.2865g/cm3之间。按照理论，2号管样品条带应处于液体1/2处，但实际条带接近管底，可能是在梯度形成过程中高浓度和底浓度的蔗糖溶液交界处分子自发运动产生新的梯度造成的。因此用密度梯度法分离样品时，可通过密度梯度的合理设置估测样品的密度。在荧光显微镜480nm激发光下看到视野中出现大量的红色椭圆形颗粒，即为叶绿体（如箭白色头所示），视野中还有部分较小的不规则红色颗粒，可能是在样品制作过程中捣碎机机械损伤造成的。