寡克隆区带检测与脑血管病

寡克隆区带检测与脑血管病北京天坛医院实验诊断中心张国军大家好！今天我们来学习一下寡克隆区带检测与脑血管病。我们从四个方面来介绍：第一方面是简单介绍一下脑血管病；第二个部分我们学习一下寡克隆区带；第三个部分我们介绍一下脑血管病与寡克隆区带；第四部分我们进行一些总结。我们来看一下什么是脑血管病。脑血管病，顾名思义，是指发生在脑部的血管，由于颅内血液循环障碍而造成脑组织损害的一组疾病。临床上以急性发病居多，大多数为中、老年的患者，现在一些30几岁的青年人发病也逐渐在增多。主要表现为半身不遂、言语障碍等等，在临床上我们经常称为中风或者叫卒中。脑血管病主要包括缺血性和出血性的两大类。缺血性疾病主要由短暂性的脑缺血发作、脑血栓形成、脑栓塞组成。出血性的疾病主要由脑出血和蛛网膜下腔出血。在国内多以脑栓塞多见，在我们国内大多是以脑出血为常见。对于临床表现，经常会表现为半身不遂、言语障碍。我的头是这边痛，另外一个病人可能是那边痛，有的病人是左侧的肢体出现一些运动障碍，有的病人表现为右侧的，所以肢体出现一些运动的障碍。通常我们大家都认为并且在很多的资料上也显示，一些心血管病在中国人群当中死亡的重要因素之一。到2005年我们监测的时候，全国的疾病监测点的系统年报上显示，总人群的首位的死因是脑血管病，的死亡率在138.52/10万。占整个死因构成超过20%，就是占总的心脑血管等等这些疾病的死亡率的22.63%。从图上我们可以看到，脑血管病的增加率、发病率和死亡率逐渐在上升，并且上升的速度也比较快。2007年医院死亡病例报告当中，就是由循环系统疾病造成的死亡病例在20多万。其中脑血管疾病伴循环系统疾病死亡的比例最高，达到了46.6%。根据流行病学的研究，与脑血管疾病有关的一些致病的危险因素主要有下面这么七个方面。排在首位的是年龄因素。从定义上我们可以看到主要的是以中老年为主。第二个就是持续的高血压。排在第三位的是心脏病，第四位是糖尿病，第五位是动脉粥样硬化，或者叫高胆固醇和高血脂。第六位是吸烟，其他的一些因素包括口服避孕药、遗传倾向等等。都可以作为脑血管疾病相关的致病因素。这里我们以动脉粥样硬化来给大家简单地介绍一下。动脉粥样硬化是脑血管疾病的一个主要的病因。脂质代谢异常和血管壁的损伤是重要的发病机理。从下边图上我们可以看到，动脉粥样硬化引起血管管腔的狭窄，最后导致了闭塞血栓的形成，引起相应的血管疾病。近年来免疫损伤引起动脉壁损伤或者动脉粥样硬化，以及脑血管病发生发展的这种研究提示，自身免疫也可能是动脉粥样硬化和脑血管病的一个重要的发病机理。从示意图上我们可以看到动脉粥样硬化和脑血管病发病的原因。现在的研究，动脉粥样硬化会引起一系列的免疫反应，可以加重或诱发脑血管病的发生。文献报道，循环免疫复合物可以沉积在血管的基底膜上，使血管壁的通透性增强，而动脉内膜通透性的增高，可以增加血管壁结构抗原的释放，从而促进抗原与抗体结合，可以加重动脉粥样硬化损伤。还有一些文献也报道，在动脉粥样硬化斑块和内膜中有免疫球蛋白和补体沉积，同样也可以引起血管壁的通透性增强，从而增加血管壁结构抗原的释放，加重动脉粥样硬化损伤。脑脊液在脑血管病当中有哪些重要的作用？我们大家知道，神经系统是一个重要的、特殊的这种免疫器官，有着独特的这种免疫反应模式。免疫效应物质像抗体，可以在神经系统、脑脊液当中可以反应出来。所以对神经系统疾病免疫机理的探讨，我们应该集中在最接近病灶而又容易取得脑脊液当中。脑脊液当中免疫球蛋白的检测不仅有助于神经系统疾病的诊断，而且还有助于探讨神经系统疾病的发病机理，以及判定血脑屏障的完整性。从神经解剖的角度上看，在中枢神经组织与外周血液之间存在着一道重要的屏障，我们称为血脑屏障，血脑屏障是由星形胶质细胞的突起与毛细血管内皮细胞壁相互结合而形成。从示意图当中我们可以回忆一下。正常的脑脊液免疫球蛋白含量非常少,我们大家学基础免疫的时候都知道，分子直径比较小的是IgG，比较容易通过血脑屏障，而分子量大的IgM是不能通过血脑屏障的，除此之外IgA的分子量也很小，但是由于IgA的含量非常低，一般仅为1-2.5mg/l，而IgG的含量相对于IgA的含量要高很多，所以达到10-40mg/l，大约为血清的1／390。因此我们通常检测脑脊液当中的免疫球蛋白主要就是IgG。这是一个模式图，我们看从外周血当中，由IgM的分子量比较大，血脑屏障是不允许通过。而IgG的分子量比较小，所以顺利的通过血脑屏障，进入到脑组织当中。在病理情况下脑脊液当中的IgG可以增高，主要的原因有这么两个方面。一个是血脑屏障遭到了破坏，使我们血浆当中的IgG可以通过血脑屏障，大量地进入到脑脊液当中。第二个就是中枢神经系统内部局部合成了IgG。由于血脑屏障破坏所导致的脑脊液当中IgG的升高主要见于中枢神经系统炎症，以及中枢神经系统的肿瘤和脑血管病。这些疾病所导致血脑屏障破坏，使血液当中的IgG大量的进入到脑脊液当中。内源性的IgG合成增加，常见于多发性硬化。脑脊液当中免疫球蛋白增高可能的机理有这么几个情况：一个是血中免疫球蛋白增高，由于某种疾病的原因使血中免疫球蛋白增高。IgG在血当中增高，由于能够通过血脑屏障进入脑脊液当中，相应的脑脊液当中的IgG也会增高。第二个就是血脑屏障受损。血脑屏障受损的时候，我们血浆当中的免疫球蛋白就都可以进入到脑脊液当中。第三个大方面，就是脑脊液流动速率下降。第四个方面，是中枢神经系统内源性合成的免疫球蛋白含量增加。血脑屏障破坏，从免疫防疫机制的角度来讲，血脑屏障是天然的生物膜系统当中的免疫屏障结构，但是容易受到多种因素的影响。像脑缺血、缺氧、炎症、肿瘤以及一些药物等等，都可能造成血脑屏障的破坏，因此会导致脑脊液当中免疫球蛋白的升高。对于脑脊液当中IgG检测，我们通常通过IgG含量的检测，鉴别是否有血脑屏障破坏后血清当中IgG对脑脊液当中IgG的影响。所以我们检测的时候，主要是检测脑脊液当中的IgG和血清当中的IgG。对临床一些疾病的发病机制的研究、诊断和鉴别诊断都具有重要的理论指导价值。下面是文献当中的报道，我们可以看一下血清当中补体和一些免疫球蛋白的检测结果。表1当中IgG的对照组和中风组，血清当中免疫球蛋白IgG检测的p值是大于0.05的，没有统计学的意义。也就是说，在对照和中风组，血清当中免疫球蛋白的含量的变化没有统计学意义。下面表2是脑脊液当中IgG在对照组和中风组中含量的变化，我们可以看具有一个明显的变化，p值小于0.01，具有明显的统计学意义。对于IgG的检测方法，我们常用的有IgG的指数，24小时IgG鞘内合成率，以及寡克隆区带。这里边我们重点介绍一下寡克隆区带的检测。寡克隆区带，正常的人体内有无数的克隆株，这种浆细胞合成的免疫球蛋白，在电泳的时候，在Y球蛋白区域会形成均匀连续的一些区带，我们称为多克隆免疫球蛋白区带。在病理免疫情况下可以使某几个克隆浆细胞异常的增生，合成一些免疫球蛋白，在电泳时在Y球蛋白区域形成几个分开的比较狭窄的不连续的区带，我们把其称为寡克隆区带。脑脊液当中寡克隆区带的出现，提示中枢神经系统内存在体液免疫反应，是检测中枢神经系统亚急性、慢性、炎性病变、鞘内免疫球蛋白合成的最可靠的指标，具有比较高的敏感性和良好的特异性。从下面图我们可以看到寡克隆区带的形成。寡克隆区带是数个无性系株B淋巴细胞在中枢神经系统局部产生的特异抗体，是针对中枢神经系统内某些特定抗原的一种特异的反应，脑脊液当中寡克隆区带阳性，提示中枢神经系统内部的免疫球蛋白异常的合成，也就是存在体液免疫反应。因此，脑脊液当中IgG我们可以通过寡克隆区带法检测。脑脊液当中寡克隆区带阳性是判定鞘内IgG合成的定性指标，为多发性硬化早期诊断可以提供重要的实验室的依据。文献也有报道，Poser在1983年的多发性硬化的诊断标准中已经把脑脊液中寡克隆区带阳性作为重要的辅助检查。在2005年修订的多发性硬化诊断标准中再次确定了脑脊液寡克隆区带阳性重要的诊断意义。因此我们说脑脊液当中寡克隆区带的检测是多发性硬化诊断的一个很重要的标准。在60年代初期的时候，Kutt等人用琼脂糖凝胶电泳检查多发性硬化患者的脑脊液，发现电泳谱当中的阴极部位，就是我们球蛋白带存在的这样的一个部位，形成不连续的几个区带，可以有多条的同源带存在，这些区带在血清及正常人的脑脊液当中是不存在的，后来Link等人他们用免疫电泳法证实了这些区带是由中枢神经系统内部的2个或2个以上的浆细胞克隆激活分泌的，像IgG分子进入了脑脊液而形成，所以命名为寡克隆IgG区带。也是寡克隆IgG区带的起源。脑脊液当中寡克隆区带检测的方法主要有哪些？检测主要是应用某种技术可以把不同蛋白区分成不同的带，可以通过多种方法，使区分开的蛋白质区带显出颜色，进而进行分析。主要的方法有垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色法。这种方法的优点是方法简便，成本低，便于在临床开展。缺点是敏感性和阳性率都比较低，缺乏IgG的特异性，同时聚丙烯酰胺对人体也是有毒性，因此现在做起来临床应用相对来说比较少。临床现在常用的是琼脂糖等电聚焦结合免疫印迹检测。敏感性和阳性率都比较高，是目前公认的检测脑脊液寡克隆区带最敏感的方法，已经成为检测脑脊液寡克隆区带的金标准。对于检测的结果，电泳之后在IgG区域靠近负极端2cm范围内可以见到2条或2条以上狭窄不连续的仅见于脑脊液而未见于血清当中的蛋白区带，我们定性为脑脊液寡克隆区带阳性。在临床当中，我们通常是分别测定脑脊液和血清当中的寡克隆区带，可能会出现以下这样的结果，出现不同的结果的时候，它的提示是不一样的。首先我们看一下：患者脑脊液和血清标本当中都没有出现寡克隆区带，提示患者中枢神经系统没有出现相关的免疫性的疾病。第二点，如果在患者血清当中出现寡克隆区带而脑脊液当中不存在，这个时候通常表明血脑屏障没有受到损伤。第三点，患者脑脊液和血清标本出现了同样的条带，这个时候通常显示患者的血脑屏障受到损伤。第四点，是脑脊液当中出现而血清当中不存在的这种极强烈的、特异的这种条带、单克隆的区带、额外的或者很弱的这种单克隆的区带，都提示有内源性的中枢神经系统合成的免疫球蛋白IgG的出现，这个时候就显示患者中枢神经系统出现了相关的免疫性的疾病，具有很有的特异性。寡克隆区带阳性通常见于哪些疾病？据国外的一些研究报道，脑脊液蛋白电泳出现寡克隆区带的阳性率：在多发性硬化症的患者当中，95％以上都会出现寡克隆区带的阳性，格林巴氏综合征大约占57％、脊髓炎为6％，其他的中枢神经系统疾病，也就是我们今天所讲到的脑血管病大约占7％左右。脑脊液当中寡克隆区带出现于大多数多发性硬化的患者当中，但是我们要清楚寡克隆区带并不是多发性硬化的特异性诊断指标，除了出现于中枢神经系统，还出现于其他的一些疾病，像一些感染、还有炎症性的疾病、副肿瘤综合征以及其他原因所引起的这种脱髓鞘性疾病，甚至是一些非炎症性的疾病当中。蛛网膜下腔出血和颅脑外伤等脑血管病患者血清和脑脊液当中也都会出现寡克隆区带。前面我们已经讲过，通常占7%左右的病人会出现寡克隆区带的阳性。因此寡克隆区带的检测对于脑血管病患者是有一定的意义。寡克隆区带在脑血管病当中有占7%的阳性率，通常都有脑出血、脑梗塞和引起血脑屏障通透性的改变，或者是完整性遭到破坏，使IgG的合成就出现了明显的升高。它的增高主要是丘脑下部和交感神经直接参与的免疫调节，通过下边神经、内分泌和免疫系统相互作用的一个示例，可以清楚地看到，神经系统，尤其是丘脑下部的交感神经可以直接参与人体的这种免疫调节的机制。像脑血管病可以是脑组织出现变化，可以是结构的变化，也可以是功能的变化。结构的变化，像我们讲神经内分泌系统功能的紊乱，神经内分泌免疫调节网络的失衡等等，脑组织破坏释放了诸如胆固醇质、脂蛋白等，嗜脂质的一些膜成分的形成最终导致B细胞激活，从而引起IgG的升高。文献当中也报道，缺血性中风病人的脑脊液当中可以检测出少克隆的lgG的区带。并且在急性脑血管病人的脑脊液当中可以查出至少一种或几种病毒抗体的这种鞘内合成。我们推测是脑卒中后．被破坏的脑组织释放一些嗜脂质的膜成