对遗传性聋基因诊断的认识

对遗传性聋基因诊断的认识（I）2015-06-05刘玉和1遗传性聋概述据2006年全国残疾人抽样调查数据，我国有听力障碍患者2780万人，占全国残疾人的33.5%，居各类残疾之首。在导致听力障碍的众多原因中，遗传因素是最重要的病因。据国外统计，每500个新生儿中就有1例是听力障碍患儿[1]，其中至少60%的新生儿听力障碍由遗传因素所致。流行病学研究显示，我国正常人群中至少5%～6%是耳聋相关基因携带者。因此，对于新生儿先天性永久性听力障碍，除非有明确的妊娠期病毒感染，所有的听力损失患者都要考虑其遗传背景。即便是后天获得性听力损失，遗传因素也可能是重要的易感因素。遗传性聋是指由来自亲代的遗传物质即致聋基因或新发生的突变致聋基因传递给后代，所导致的耳部发育异常、代谢障碍、细胞结构或功能异常，以致出现的听功能不良。遗传性聋中70%为非综合征性聋（即不伴有任何非听觉内耳方面的症状和体征），30%是综合征性聋。遗传性聋中的绝大部分是感音神经性聋，极少部分是传导性聋、听神经病和中枢性聋。研究证实遗传性聋是经典的单基因遗传病，具有高度的遗传异质性，目前已经克隆的与遗传性聋相关的基因为118个。随着科技的迅猛发展，会有越来越多的耳聋相关基因被克隆和确定，这将为遗传性聋的临床基因诊断奠定基础。2遗传性聋相关基因的研究现状自1992年Leon等采用DNA微卫星标记基因连锁分析的方法定位第一个常染色体显性遗传性非综合征性聋基因座（DFNA1）和1993年Prezant等第一次报道线粒体12SrRNA1555位点A-G的突变是氨基糖甙类抗生素致聋的易感基因开始，人类进入了遗传性聋研究的新纪元。1994年Guilford等定位了第一个常染色体隐性遗传性非综合征性聋基因座（DFNB1），随后1997年Lynch等和Kelsell等相继克隆了第一个常显和常隐非综合征性聋基因，同期，综合征性聋的相关基因研究也取得进展。随着人类基因组计划的完成和基因定位克隆筛选技术以及测序技术的不断改进与完善，国际上遗传性聋致病基因的定位克隆及确定工作近年来取得了令人瞩目的进展。目前已有175个非综合征性遗传性聋基因座被定位，包括64个常显基因座和101个常隐基因座以及性连锁和其他相关基因座，至少118个遗传性聋相关基因被克隆或确定。而遗传学家估计至少有300～500个基因与遗传性聋相关，仅从与人类共享99%同源基因的小鼠分析，在90个与内耳发育和功能相关的基因中，只发现28个基因与人类耳聋相关。因此，遗传性聋的基因克隆研究任重而道远。就目前的研究发现，遗传性聋几乎包含了所有的遗传方式，包括经典的孟德尔遗传即常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁显性遗传、X连锁隐性遗传以及Y连锁遗传，也包括线粒体母系遗传和表观遗传如DNA甲基化和rRNA基因沉默等，其中常染色体隐性遗传约占80%，常染色体显性遗传约占18%。此外也有新发突变致遗传性聋发生的报道。遗传性聋的遗传异质性不仅表现在遗传方式和相关基因多样，还表现在基因突变类型的多样，如点突变、单个碱基或小片段的插入缺失突变以及大片段插入缺失突变和拷贝数异常等。且突变基因以及突变基因型热点不突出，在不同种族不同人群中存在差异。我国遗传性聋的流行病学研究发现，在已确定与非综合征性聋相关基因中，GJB2和SLC26A4基因的病理性突变导致遗传性聋的比例较大，所占比例分别约为21%和14.5%。其他耳聋相关突变基因和突变位点热点不突出，甚至有一些耳聋相关突变基因只在个别家系中得到验证。遗传性聋的相关基因主要集中在缝隙连接蛋白家族（膜蛋白）、离子通道蛋白、非传统肌球蛋白家族（结构蛋白）、转录因子、细胞外基质蛋白以及参与细胞代谢的各种酶类等几类蛋白基因，也包含编码RNA的基因序列，表现出明显的遗传异质性。除此之外，遗传性聋还表现出表型多样，即综合征性聋或非综合征性聋，先天性或后天迟发进展性聋，轻中度至重度或极重度聋，低频、中频、高频或全频听力下降。从遗传性聋的基因型与表型关系研究中可发现，有的基因仅与综合征性聋有关，有的仅与非综合征性聋有关；有的仅与低频听力下降有关，有的与先天全频听力下降有关等；但也发现：同一基因不同突变表型差异可能很大，可引起综合征性聋，亦可引起非综合征性聋；既可导致显性遗传，也可导致隐性遗传。总之，遗传性聋基因型与表型同样复杂。尽管遗传性聋具有广泛的遗传异质性，但绝大多数非综合征性遗传性聋仅由单基因致病，这为遗传性聋临床基因诊断的开展提供了理论基础。刘玉和简介：刘玉和，男，北京大学第一医院耳鼻咽喉科主任医师，教授，博士研究生导师；国家卫生计生委新生儿听力筛查专家组成员；中华医学会耳鼻咽喉头颈外科分会青年委员、听力学组成员；中国中西医结合学会耳鼻咽喉头颈外科遗传性聋专业委员；北京医学会耳鼻咽喉头颈外科分会委员；国家自然科学基金委基金评审专家等。《中华耳科学杂志》、《听力学及言语疾病杂志》、《中国听力语言康复科学杂志》等杂志编委。先后承担多项国家自然科学基金、吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金、首都特色研究基金等课题。近年来以第一作者或通讯作者发表SCI收录论文10篇，在国内核心期刊发表论文40余篇。专业特长：耳科学与听力学。3遗传性聋基因诊断的意义耳聋发病率高，在我国每年有3万左右聋儿出生，其中大部分为重度、极重度感音神经性聋。尽管自上世纪90年代，世界发达国家和许多发展中国家均开展了新生儿听力筛查，为先天性耳聋患儿早期诊断与干预提供了保障，遗传性聋的分子生物学诊断（相关基因诊断）仍有不可替代的作用。首先，基因诊断可以明确近一半先天性聋的病因；其次，建立在新生儿耳聋基因筛查基础上的基因诊断可以尽早发现并诊断迟发性耳聋，为迟发性耳聋的早期干预创造条件；第三，耳聋患者的基因诊断可以为患者及亲属提供遗传咨询；第四，育龄夫妇的耳聋基因筛查和产前基因诊断可以有效预防遗传性聋的发生；最后，基因诊断可以将遗传性聋分型和分类，指导临床耳聋管理、药物治疗或听觉干预。同时，耳聋易感基因诊断可为通过预防致聋因素避免耳聋的发生提供依据。尽管助听器和人工耳蜗等助听设备能够解决很多遗传性聋所致听力障碍问题，但昂贵的费用和少部分差强人意的康复效果，令许多患者及家庭难以接受。因此，对遗传性聋的有效预防是解决这一难题的有效途径之一。而遗传性聋有效预防的前提是耳聋基因诊断。新生儿听力筛查的普及为遗传性聋的相关基因筛查（基因诊断）提供了条件，二者的结合将是临床遗传性聋的早期规范化诊断的标准。通过建立高效的耳聋基因诊断技术平台和耳聋出生缺陷三级预防综合防控体系，采取有效的干预措施，减少耳聋出生缺陷，是我国人口战略的重要内容，意义深远。4遗传性聋基因诊断技术及方法进展尽管从20世纪90年代初起，国内外学者就开始研究耳聋的基因检测，但由于遗传性聋的相关基因目标未知，遗传学家只能通过微卫星连锁分析方法对单个遗传性聋家系进行相关基因的定位，并通过第一代测序技术（Sanger测序）进行基因突变的检测，或结合PCR－RFLP、PCR－SSCP、PCRdHPLC等技术筛选相关基因的突变。少数通过基因功能克隆的方式确定耳聋相关基因检测到突变。进入21世纪，遗传学家通过共同祖先原理或SNP进行连锁分析，在遗传性聋相关基因确定方面也取得了一定突破。但是在很长一段时间里，由于DNA测序技术的局限性及致聋基因突变的高度异质性，未知基因遗传性聋的基因诊断临床应用有限。基于芯片技术和飞行时间质谱检测技术的热点突变快速筛查结合Sanger测序在国内很快被接受并应用于临床，具有简单、快速、方便、便宜等优点。目前已证实与遗传性聋相关的基因118个，发现致病突变至少1000个，还有许多新突变被不断报道，因此，上述技术的缺陷是显而易见的。近年来，分子生物学技术大量创新性突破和国内外大量的耳聋基因基础研究，为开展耳聋临床基因诊断提供了良好的理论依据和技术支持，同时越来越多的耳聋患者及家属要求了解自身耳聋病因。2009年Ng等利用大规模平行测序技术对一个体的全基因组外显子进行测序，开辟了人类基因诊断的全新时代。短短几年，遗传学家已利用第二代测序技术确定了十几个新的遗传性聋相关基因。如2010年报道了第一个使用大规模测序技术诊断非综合征性聋的病例，研究者对比了大规模测序技术和Sanger测序法的灵敏性与特异性，发现前者的灵敏性和特异性高达99.72%和99.00%，表明大规模测序技术可以为耳聋患者提供详尽的基因测定。2011年，Brownstein等用大规模测序技术测定了11例耳聋家系先证者中的246个基因，结果发现这些先证者均没有GJB2基因的突变，但在6例先证者中发现了同一种突变基因，且为非综合征性聋基因；研究者随后为同种族的其他耳聋患者进行基因测序，在20个耳聋家族得到了相同的基因诊断。这项研究显示了大规模测序技术在基因诊断中的潜力。最近有文献报道利用新一代测序技术发现一个由致病基因CACNAID所引起的新的综合征性聋，临床表现为耳聋与窦房结功能不良（sinoatrialnodedysfunctionanddeafness，SANDD）；研究者通过对比研究两个有血缘关系的基因型和表型相近的患病家系后发现，CACNAID编码L型电压门控通道的功能为控制内毛细胞带状突触谷氨酸盐的释放以及窦房结中钙离子的释放；体外试验亦证实了该基因的突变会影响钙离子通道。在没有基因诊断之前，SANDD患者多以非综合征性聋就诊，因为窦房结功能不全往往是在疾病后期患者发生晕厥后才被发现。新一代测序技术不仅能够用于新致聋基因研究，且能更好地应用于已知耳聋相关基因突变诊断。2012年冯永等利用二代测序技术开发了针对130个已知耳聋相关基因外显子测序的诊断方法，建立了IlluminaGoldengate384K高通量耳聋基因筛查芯片工作平台。与此同时，深圳华大基因研究院采用安捷伦技术（Agilent的SureSelect液相靶向序列捕获系统）开发了针对51个耳聋基因外显子的高通量测序平台。2013年杨涛等[18]应用已开发的针对79个耳聋相关基因外显子的新一代测序工作平台完成了190例耳聋的基因诊断。随着第二代高通量测序技术的发展与逐渐成熟，遗传性耳聋的临床基因诊断越来越准确、简单和快速。基于新一代测序技术基础上的耳聋相关基因外显子序列或全序列分析（目标基因的靶向序列分析）、全基因组外显子序列或全基因组序列分析已经变成现实。