影响_MS培养基凝固效果的几个因素的研究

影响MS培养基凝固效果的几个因素的研究在植物组织培养过程中，一般用琼脂作固化剂使培养胶化，其凝固效果直接关系培养材料的生长或生存。目前已有不少关于培养基高温高压灭菌后pH值变化的研究；但对于影响培养基凝固效果的具体因素研究极少。笔者以MS培养基为对象，探讨影响其凝固效果的多方面因素，以利于组培材料的生长。1材料与方法1.1材料与药品MS培养基；琼脂条(海洋食品有限公司制)；琼脂粉(日本进口，上海化学试剂)；碳源：蔗糖、果糖、食用白糖、葡萄糖；活性炭。1.2方法将母液兑成完全MS培养基，用稀HC1或稀NaOH调节培养基的pH值至所需水平，在每个容量为50ml的三角瓶中统一装入30ml培养基。在不进行其相关因素实验时，培养基中都是添加了3％蔗糖和0.8％的琼脂粉，分装前pH值调至5.8，118～120℃灭菌20min。pH计型号pHS-3c型酸度计，采用全量程复合玻璃电极，可精确设置被测溶液的温度，实现温度补偿，读数准确，方便快捷。3次重复，灭菌后培养基置于25℃室内1h后观察，采取多次观察分析，用平均值进行结果统计。2结果与分析2.1琼脂浓度和培养基pH值对培养基凝固效果的影响2.1.1琼脂的浓度对MS培养基凝固效果的影响。表1显示，琼脂作为固化剂对培养基的凝固有直接影响，浓度的高低直接关系到培养基的凝固效果，培养基的凝固效果与琼脂用量呈正相关。一般情况下，琼脂浓度低于0.6％，培养基就不能很好地凝固，当浓度达0.8％一般就能满足实验要求。琼脂在培养基中仅作为固化剂，但其中含有多种杂质成分，可能对培养基成分会有一定的影响，在用量上应加以考虑。日本进口的琼脂粉比琼脂条的凝固效果稍好，主要是因为琼脂条的杂质多，琼脂粉的有效成分相对高一些。这与陈永勤的研究结果相反。表1琼脂浓度和培养基pH值对培养基凝固效果的影响琼脂浓度g/L培养基pH4.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.005A(a)A(a)A(a)B(a)B(b)C(b)C(b)C(c)C(c)C(c)C(c)6A(a)A(a)A(a)B(b)B(b)C(c)D(c)D(d)D(d)D(d)D(d)7A(a)A(a)B(a)B(b)C(c)D(d)D(d)D(d)E(d)E(e)E(e)8A(a)A(a)B(b)C(c)D(d)D(d)E(d)E(d)F(f)F(f)F(f)9A(a)B(a)C(c)C(c)E(d)F(e)F(e)F(f)F(f)F(f)F(f)10A(a)B(b)C(b)C(c)E(d)F(e)F(f)F(f)F(f)F(f)F(f)11B(a)B(b)C(c)D(c)E(e)F(f)F(f)F(f)F(f)F(f)F(f)注：大、小写字母分别表示进口琼脂粉和国产琼脂条。A或(a)，凝固很差、完全液体状态；B或(b)，凝固差、稀糊状；C或(c)，凝固一般、轻晃动时会滑动；D或(d)，凝固较好、不太滑动；E或(e)，凝固好、不滑动；F或(f)，凝固很好、很硬、培养基上有一层水。下表同。2.1.2pH值对MS培养基凝固效果的影响。MS培养基的凝固与pH值呈正相关。当pH值低于5.50时，培养基一般不能很好地凝固，随pH值的提高，培养基的凝固效果明显改善。植物组织在一定pH值下才能正常生长，因此在配制时考虑培养基凝固情况的同时，也要注意pH值的大小。2.1.3琼脂的用量与培养基pH值的互补作用。试验表明，当琼脂浓度过小时，可通过提高培养基的pH值来改善凝固效果；当pH值低时也可以通过增加琼脂的浓度来改善凝固效果，这与陈永勤的研究相一致。2.2碳源对MS培养基凝固效果的影响在培养基中一般要加入一定量的碳源，碳源有降低培养基灭菌后凝固效果的效应。表2显示，碳源添加后，灭菌后培养基的凝固效果明显降低，降低程度与所添加的碳源量呈正相关；不同碳源培养基的下降程度有差异：添加3％蔗糖、2％食用白糖、1％葡萄糖或1％果糖时就能明显降低培养基灭菌后的凝固效果。相同条件下，果糖与葡萄糖的影响较大，能显著降低培养基的凝固效果，下降程度是果糖葡萄糖食用白糖蔗糖。添加一定量的碳源促进了培养基灭菌过程中pH值的下降。Ball认为在高温灭菌时，培养基中蔗糖会水解成果糖和葡萄糖，而葡萄糖进一步变成葡萄糖酸，从而导致培养基pH值的下降。碳源在灭菌过程中水解，形成酸性物质，使培养基pH值下降，从而凝固效果降低。添加果糖、葡萄糖影响明显，由于高温灭菌后，果糖培养基的pH值比葡萄糖的下降幅度大得多，更易形成酸性物质。表2碳源对MS培养基凝固效果的影响碳源种类碳源浓度%012345蔗糖E+EE-D+C+C食用白糖E+E-D+DCC-葡萄糖E+DDC+CC-果糖E+D-CCBB注：“+”表示凝固效果略高于标记水平；“一”表示凝固效果略低于标记水平。表4同。2.3灭菌时间及灭菌温度对MS培养基凝固效果的影响由表3可知，经高温高压灭菌后培养基的凝固效果呈下降趋势，灭菌时间和灭菌温度均不同程度地影响MS培养基的凝固效果。130℃以下灭菌l2、15、18、20min后培养基的凝固效果稍有降低，各个处理表现基本一致，无明显差异；但当灭菌时间达25min以上或灭菌温度达130℃时，培养基的凝固效果呈急剧下降，使原凝固很好的培养基凝固不好或根本不能凝固。这可能是在高温或长时间高压下，琼脂的有效成分结构被破坏，凝固能力减弱；同时培养基一些营养物质在高温下水解成酸性物质，造成培养基pH值下降。常规高温高压灭菌温度118～125℃，灭菌时间15～20min，培养基的凝固会有所下降，主要是因为培养基在经高压灭菌后pH值下降了，pH下降的原因可能是高温灭菌时EDTA铁盐和其他微量元素发生了相互作用。2.4添加活性炭对MS培养基凝固效果的影响在植物组织培养中为了吸附植物的有害泌出物或防止组织褐变等，在培养基中通常加入一定量的活性炭。表4显示，在高压灭菌后培养基的凝固程度明显下降，但灭菌前加入活性炭的培养基凝固程度会急剧降低，能降低一到两个凝固级别；活性炭的含量不同，降低的程度略有差异，但差异不大。表3不同高温下灭菌不同时间对MS培养基凝固效果的影响灭菌温度℃灭菌时间0121518202530115-120EDDDDCC120-125EDDDDCC125-130EDDDCCB130-135ECCBBBA活性炭具有很强的吸附能力，有削弱琼脂凝固能力的作用。在配制培养基时要增加琼脂的量或提高pH值来改善培养基在灭菌后的凝固状况。表4不同浓度活性炭对MS培养基凝固效果的影响活性炭浓度(g/L)灭菌前各培养基凝固程度ABCDEF0A-B-C-D-E-F-1A-AB-CDE2A-A-B-C-DE3A-ABC-D-E4A-A-B-BCE-2.5晃动培养基对凝固效果的影响在培养基冷却凝固过程中，晃动培养基也对培养基的凝固效果有较大影响，影响程度与晃动剧烈程度呈正相关，对B(b)、C(c)、D(d)、E(e)状态的培养基影响十分显著，使凝固不好的培养基不能凝固，凝固好的不能很好地凝固。但对于不能凝固的和很硬的培养基影响不大(表5)。这在N6、B5等培养基凝固反应上是一致的。在实验中经常用到的是D(d)、E(e)两种凝固状态，因此晃动培养基对凝固效果也有一定影响。晃动培养基主要是破坏了琼脂的结构。表5晃动培养基对培养基凝固效果的影响对照晃动级别IIIIIIIVVAAAAAABBBAAACCBBBBDCCCCBEEEEDDFFFFFF注：I.轻轻摇晃2圈；Ⅱ.在I的基础上稍加大力度，摇晃4圈；III.摇6圈；IV.摇晃8～10圈；V.剧烈晃动培养基。3小结与讨论通过分析琼脂的浓度、培养基的pH、灭菌时间及灭菌温度、碳源、活性炭、晃动培养基对MS培养基凝固效果的影响，表明MS培养基的凝固效果主要是受琼脂浓度和培养基的pH值影响；高温高压灭菌后培养基凝固不好，主要是因为培养基的pH值下降了，灭菌时间、灭菌温度、碳源、活性炭等因素影响MS培养基的凝固，主要是因为它们在灭菌的过程中有改变培养基pH值的效应。在其他培养基如N6、B5、White等培养基效果也同样主要受这两方面因素的影响；相同情况下，培养基之间的凝固效果不同，主要是因为在高压灭菌过程中影响因素的影响效应有所差异。在植物组织培养过程中，培养基的DH值是由培养的植物材料不同而决定，但培养过程对培养基的凝固效果的要求并不因pH值而变，所以对某种特定培养对象，即要考虑培养对象所要求的pH值，又要通过调整某些因素保证培养基具有一定的凝固程度。