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微生物学实验实验项目名称和学时分配序号实验项目名称学时分配实验属性实验类型实验者类别每组人数必开/选开1显微镜的使用和真菌形态的观察3基础类验证性本科生必开2革兰氏染色法3基础类验证性本科生必开3酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别3基础类验证性本科生必开4微生物大小的测定及计数3基础类验证性本科生必开5牛肉膏蛋白胨培养基的制备3基础类验证性本科生必开6土壤中细菌的分离纯化6基础类综合、设计性本科生必开7菌种保存6基础类综合、设计性本科生必开合计27说明：在上述12个实验中根据实验材料情况压缩合并成9个实验。实验内容、要求和所用设备1、实验内容实验一显微镜的使用和真菌形态的观察一、[目的要求]熟悉普通光学显微镜各部分的结构和性能。观察真菌的基本形态。二、[实验原理]1.光学显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。2.油镜通常标有“OI”或“HI”字样，有时也有用刻一圈红线或黑线为标记的。用不同放大倍数的目镜可使被检物体放大1000-2000倍。三、[实验步骤]1.调节光源2.低倍镜观察3.高倍镜观察四、[实验报告]1.实验结果绘出所观察到的真菌形态，并注明物镜放大倍数和总放大倍数。2.思考题根据你的实验体会，谈谈如何根据所观察微生物的大小选择不同的物镜进行有效观察。实验二革兰氏染色法一、[目的要求]了解革兰氏染色的原理；掌握革兰氏染色的方法。二、[实验原理]根据革兰氏染色反应的结果，可将所有细菌分为两类：呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示；三、[实验步骤]（插片法）1.涂片2.固定3.染色4.干燥5.镜检四、[实验报告]1.实验结果报告所观察到的两种细菌革兰氏染色的结果并绘图。2.思考题1.革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？2.革兰氏染色成败的关键在哪一步？为什么？应如何掌握？实验三酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别一、[目的要求]1.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。2.掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。二、[实验原理]酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。三、[实验步骤]（美蓝水浸片观察）1.挑菌（0.1%吕氏美蓝溶液）2.加盖片3.镜检4.用0.05%吕氏美蓝溶液重复上述实验。四、[实验报告]1.实验结果（1）绘出所观察到的酵母菌的形态特征。（2）说明观察到的吕氏美蓝溶液浓度和作用时间对死、活细胞数的影响及其原因。2.思考题五、[实验报告]1.实验结果绘出所观察到的放线菌的形态特征。2.思考题酵母菌与细菌在形态大小、细胞结构、繁殖方式上有何区别？实验四微生物大小的测定及计数一、[目的要求]1学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。增强微生物细胞大小的感性认识。2.明确血球计数板计数的原理3.掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。二、[实验原理]微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。三、[实验步骤]1.目镜测微尺的标定2.菌体大小的测定3.用毕后处理取出目镜测微尺，将目镜测微尺和镜台测微尺用檫镜纸檫试干净，放回盒内保存。4.稀释5.镜检记数室6.显微镜记数7.清洗血细胞记数板四、[实验报告]1.实验结果将测得的菌体大小值填入表中。2.思考题若目镜和目镜测微尺不便，只改用不同放大倍数的物镜测定同一菌体时，其测定结果是否相同？为什么？3.根据你实验的体会，说明用血细胞记数板的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？实验五牛肉膏蛋白胨培养基的制备一、[目的要求]1.明确培养基的配制原理。2.通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。3.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。4.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。二、[实验原理]牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。三、[实验步骤]1.称量2.溶化3.调PH4.过滤5.分装6.加棉塞7.包扎8.灭菌9.搁置斜面10.无菌检11.灭菌四、[实验报告]1.实验结果记录本实验配置培养基的名称、配方、配制过程，并分析其中的碳源、氮源、能量、无机盐及维生素的来源。2.思考题1.在配制培养基的操作过程中应注意些什么？为什么？其中关键操作是什么？2.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？若不能及时灭菌应如何处理？3.高压蒸汽灭菌时为什么先要将锅内冷空气排尽？灭菌后压力未降到“0”为什么不可开盖？实验六土壤中细菌的分离纯化一、[目的要求]该项实验是我实验室自行设计编排的，其特点是将培养基制备、高压灭菌、平板制作、细菌菌落计数、接种、分离方法等最基础的微生物学实验技术引入本科生实验教学中，设计综合了从土壤微生物群落中分离培养细菌的整套实验内容。通过该项实验可使学生练习观察细菌群体特征的方法，并能对各特征进行正确的区分，了解对群体特征描述中一般语言的使用及其准确性，并提高实践动手能力的同时培养学生独立分析、解决问题的综合能力，培养学生科学的思维能力和创新意识，养成理论联系实际，勇于探索的科学精神。二、[实验原理]微生物在自然界不是单一纯粹地存在，欲获得所需菌种，必须进行分离、接种、培养。分离方法很多，主要有平板划线分离、平板倾注法、选择培养基法、单细胞挑选法，接种方法主要有斜面接种、液体浸染接种、穿刺接种、液体接种、点植接种等，可以根据实验需要分别选用。微生物培养方法很多，主要有需氧培养、厌氧培养，培养温度不同等。菌落主要特征包括大小、形状（正面、侧面）、边缘状态、表面状况（湿润、光滑、干燥、粗糙、绉褶）、颜色（菌落本身的颜色和分泌的可溶性色素）、透明程度（不透明、半透明、透明）。菌落特征与细胞结构密切相关，但也与培养条件、培养成分、生长情况有关。因此观察菌落特征有一定的缺陷性。平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在合宜温度下培养，1-2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。三、[实验步骤]1.制备土壤稀释液将采集晾干的土样研碎并过筛，取10g研细的土样装入盛有90ml灭菌水的三角瓶中，混匀，制成土壤悬浮液，稀释度为0.1。从中取出1ml土壤悬浮液移入装有9ml灭菌水的试管中，摇匀，稀释度为0.01。再将其分别稀释10和100倍，稀释度分别为0.001和0.0001。2.涂布平板从上述四种稀释度的土壤悬浮液中各取1ml，无菌操作分别移入已制备好的燕麦平板培养基表面，用L型玻棒将土壤悬浮液摊平，每个土样设3个重复。3.培养将涂好平板标记，置于28℃恒温培养箱内黑暗培养，48h后记录菌落形成单位（cfu）。从纯净的菌落边缘挑取少量菌丝移入另一平板培养基上，28℃暗培养至获得纯菌株。4.挑菌落四、[实验报告]1.实验结果（1）将你自己的平板记录在表中。（2）与其他同学所做的结果进行比较。2.思考题（1）如果用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为该怎么处理？(2)为什么熔化后的培养基需冷却45℃左右才能倒平板？（3）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？实验七菌种保存一、[目的要求]该项实验将培养基制备、高压灭菌、斜面制作、细菌菌接种、分离方法及无菌操作等最基础的微生物学实验技术引入同一实验中，将微生物学的基础操作有机结合。通过该项实验可使学生熟练微生物菌种保存的基本方法，掌握微生物无菌操作计数，了解菌株保存在科学研究与生产中的意义，并提高实践动手能力的同时培养学生独立分析、解决问题的综合能力，培养学生科学的思维能力和创新意识，养成理论联系实际，勇于探索的科学精神。二、[实验原理]为保持细菌原有的性状和活力，通过人为方法提供一定的条件，使细菌在低温、干燥、缺氧的环境中，生长受到抑制、新陈代谢处于最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保存菌种的目的。斜面保存法，亦称传代培养保藏法，是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。三、[实验步骤]1培养基制备1.1器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。1.2溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。1.3调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。1.4加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。1.5过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。1.6包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。1.7灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。1.8斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。1.9无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。2接种2.1斜面接种把菌种点接在斜面中部偏下方处、从斜面中央自下而上划一直线或者从斜面底部自下而上划“之”字形线。3培养及无污染检查将接种斜面存于培养箱内30℃培养1～3天，检查菌落无污染后于4℃下长期保存。四、[实验报告]1.实验结果记录本实验配置培养基的名称、配方、配制过程。2.思考题（1）有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例生长的基质中，为什么在配置培养基时要注意各种营养元素成分的比例？（2）你配置斜面培养基有污染吗？说明产生或未产生的原因。（3）菌种保存实验注意事项有哪些？实验主要设备和台件数序号设备名称每组应配台件数实验项目备注1显微镜显微镜的使用和真菌菌形态的观察2显微镜革兰氏染色法3显微镜酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别4①显微镜②血细胞记数板微生物大小的测定及计数5①培养基分装器②高压蒸汽灭菌锅牛肉膏蛋白胨培养基的制备6①移菌环②高压蒸汽灭菌锅土壤中细菌分离纯化7①无菌平皿、试管②试管架菌