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实验一、微生物的简单染色思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？答：油镜在使用时必须在载玻片与物镜之间滴加镜头油。油镜使用过程中要注意两点：（1）、使用后镜头的清洁：镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用完油镜必须进行“三擦”（观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液）擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原）。（2）、.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。2、使用油镜时，为什么必须用镜头油？答：在使用普通显微镜时，当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？答：低倍镜视野比较大，能看到的范围大，容易找到观察的目标，然后在用放大倍数高的高倍镜或油镜有目的的观察。实验二、革兰氏染色（1）为什么必须用培养24h以内的菌体进行革兰氏染色？答：24h以内的菌体处于活跃生长期，菌体细胞壁具有典型特征，而处于老龄的革兰氏阳性细菌壁结构开始发生变化，染色时会被染成红色而造成假阴性（2）要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键步骤？为什么？答：应注意如下几点：其一，选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性；其二，涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；其三，脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性（3）当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？答：当要确证未知菌的革兰氏反应时，可用已知菌进行混合涂片，使二者染色条件保持一致，如果已知菌的结果与预期相符，则证明操作操作正确，结果可靠。实验三、微生物的显微镜直接计数法1、在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？答：1）优点：直观、快速、操作简单。2）缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；实验四、微生物大小的测定1、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？答：相同；目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确等分的刻度，有把5毫米刻成为50等分或把10毫米长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，物象的放大倍数与每小格目镜测微尺所代表的长度在变化比例上是同步的，故而测定结果相同。实验五、培养基的配置与高压蒸汽灭菌1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是否无菌？为什么要倒置培养？答：由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长系列而消耗养分和改变培养基的酸碱度所带来的不利影响。将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可证明灭菌后的培养基无菌。倒置培养的主要目的：1）由于重力的作用使培养基表面及次层能富集微生物生长所需的营养物质，利于微生物生长；2）防止空气中微生物的污染培养基及培养物：倒置时平板内的空气是不流动的,杂菌不会沉降到培养基表面,如果不倒置,很快平板周边会长起杂菌。3）倒置培养使琼脂里水分不易蒸发出去，而充分的保持琼脂的弹性与细菌容易繁殖和生存的环境。如果不倒置，大概3天左右培养基就会出现龟裂等水分散失的情况。而一些落菌等试验，需验证培养基无菌，就要先倒置培养48小时才可作为模板做落菌，水分散失是很重要的。2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？答：一般而言，培养基的配置要注意如下几点原则：1）、营养成分的配比：碳源和氮源的比例（C/N）要适当；2）、适宜的酸碱度（pH值）：配制培养基时pH的调节；3）、渗透压：营养物质要有适合的浓度；4）、培养基不能反复高温灭菌。5）、称不溶性固形物时，应单独称，若量少的可以与无机盐一起称，但一定要混匀再分装；6）、一般情况下培养基用自来水配制。操作细节上则要注意：1）、称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖2）、调pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度3）、分装时注意不要污染棉塞、试管口，以免染菌。4）、及时灭菌，以免培养基及容器里的微生物生长繁殖消耗养分、改变酸碱度。3、高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物。答：1）在使用高压蒸汽灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。2）压力未降至“0”便开盖取物的可能后果：压力锅内压力骤然降低，引起容器中的溶液喷出容器口导致污染或导致人员的烫伤。实验：化学因素对微生物的影响1、利用滤纸片法测定化学消毒剂对微生物生长的影响时，影响抑菌圈大小的因素有哪些？答：微生物的种类；化学消毒剂的含量；培养的条件；滤纸片的大小、厚度；接种量的大小等。实验：霉菌的形态观察1、你主要根据哪些形态特征来区分四种霉菌？答：1）菌丝特征：青菌与曲霉菌丝与膈；毛霉与根霉则无；2）菌丝的特化结构：曲霉有足细胞，其它霉菌无；根霉有假根与匍匐枝，其它霉菌无；3）孢子头特征：青霉的孢子头为扫帚状；根霉与毛霉的孢子头为囊状；曲霉为菊花状孢子头。实验：四大类微生物菌落形态观察1、请你从六个方面描述四大类微生物菌落形态的特征。２、答：总体可从各类微生物菌落的形状、大小、色泽、透明度、致密度、边缘着手描述它们的特征。实验：细菌特殊结构的染色1、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因?答：1）营养缺乏，培养条件不适宜，芽孢杆菌群体形成抗逆体2）培养时间太长，营养体已大部分形成芽孢且芽孢囊破裂游离出来。2．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?答：荚膜为粘液状或胶状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽；因为含水量高，遇热易失水变形，故而固定时采用自然晾干的方法固定。实验：酸奶1、如果你利用生牛乳通过细菌自然发酵制造能饮用的酸牛乳，应控制在哪一时期？答：从牛乳酸败过程中细菌的生态演变过程来看，生牛乳的状态经历了几个阶段的变化：1、牛乳ＰＨ中性，含丰富的乳糖——乳酸ＰＨ下降；2、引起蛋白质结块———抑制了乳链球菌的繁殖3、乳杆菌能耐受低ＰＨ，发酵乳糖————ＰＨ更低4、酵母菌在这低ＰＨ环境下利用乳酸生长———乳糖、乳酸消失，ＰＨ上升；5、假单胞菌、芽胞杆菌能产生蛋白酶，分解凝结的牛乳蛋白，当蛋白质被利用完毕，牛乳的分解也就完成了。在第三阶段，也是生牛乳中乳糖被天然微生物充分发酵生成易被人体消化吸收的乳酸的时期，故而应控制在第三阶段。