微生物纯种的分离方法

微生物纯种的分离方法自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。要研究其中的某一种微生物，首先必须将它分离出来。下面介绍几种纯种微生物的分离方法。平板划线分离将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板，用接种环沾取少量待分离的材料，在培养基表面平行或分区划线(图5-5)，然后，将培养皿放入恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。液体稀释法将待分离的样品经过大量稀释后，取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面，培养后就可能得到单个菌落。利用选择培养基进行分离不同的微生物对不同的试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基。用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的。菌丝尖端切割这种方法适于丝状真菌。用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端，将它们移到合适的培养基上培养后，就能得到新菌落三、细菌的分离与计数（一）背景知识介绍1.细菌的分离与纯化自然界的细菌总是以杂居的方式存在，如土壤、水、空气等都分布着种类繁多的细菌。我们如何知道这些杂居的细菌是哪种细菌呢？这就需要将这些带菌的材料中混杂的细菌，经过稀释，使其分散成单个存在的菌体，在固体培养基平板上，长成肉眼可见并具有一定特征的菌落。这些菌落分离出来，进行纯培养。所谓纯培养即在一个培养物中，所有的细菌都是由一个细菌分裂繁殖而产生的后代。这种获得单一菌株纯培养的的方法称为细菌的分离。常用的分离方法有稀释法和划线法。（二）课题提出：我们的身体和周围的环境有大量的细菌，细菌与我们的生活和健康密切相关。但是，自然存在的细菌都混杂在一起，我们要想研究和了解各种细菌的形态结构和功能，就要对其进行分离纯化，才能进行深入的研究。如对一些致病菌的研究，食品卫生的研究，微生物工业的研究等。在研究过程中，有时需要调查和检测细菌密度，则需要统计细菌的数量。如对环境污染（水污染、空气污染、食品污染）的监测和检查，现在公布的空气污染度中，有一项即是细菌数量。所以，分离与计数是对细菌研究的基本方法。如果调查不同深度土壤中细菌的种类和数量，通过对样品进行分离和计数，然后再进行比较。对使人生病的细菌，其检查也要采取此方法。如当皮肤受伤时则容易发炎，皮肤中的那些细菌在引起炎症？再如，食物的变质、蔬菜水果的腐烂、水的污染、生活用水标准的检测、饮料和食品合格的检查等，都可以作为课题进行研究。分离与计数是微生物研究中非常基本和常用的方法，涉及面很广。（三）活动范例【活动课题】对校园不同环境尘土细菌数量的调查。【课题概述】土壤中细菌的数量大，种类多。但是不同的土质及土壤的不同深度，细菌的数量和种类是不同的。那么，我们生活的环境中，土壤里的细菌数量和类型有没有区别呢？教室是人集中的场所，由于人多杂菌也多；操场是学生运动的场所，人虽然很多，但直接暴露在阳光下，其中的细菌会比教室少吗？【活动过程】（1）样品的采集：在教室不同方位的角落的地面用刷子，扫取尘土，放入洁净的容器中；在操场中央及四个角扫取少量的尘土，放入洁净的容器中。（2）菌液的制备：将教室土样和操场土样各称取10g，分别在火焰旁加入装有90ml无菌水的三角瓶中，震荡5分钟使菌分散。制备成10-1（1/10）的菌悬液。（3）稀释：准备已灭菌的装有9ml无菌水的试管14只（每个样品7支），按10-2～10-8顺序编号。然后用无菌移液管从教室样品10-1菌悬液中，摇均后吸取1ml放入1号试管，用手轻压移液管的橡皮头，吸三次将移液管中的菌悬液洗下并混匀。再用无菌移液管按上面方法稀释操场尘土样品。（4）接种培养：准备好经过灭菌的、温度在50℃牛肉膏蛋白胨培养基约300ml；经过灭菌直径9cm的培养皿18套（每个样品9套），并编号10-6、10-7、10-8，每个稀释度各3套，即做三个重复以便观察。待放凉凝固后，将平板倒置放入37℃恒温箱中培养1～2天。（5）结果观察：经过培养后，平板的表面长出菌落。不同的细菌其菌落的形态也不同；根据平板菌落的数量计算出样品所含菌数。（6）记录如下：①菌落数：计算3个重复菌落的平均数。平板上菌落数，以第二个稀释度长有50个左右菌落为最佳（太密了不好数）。如果太密，可进一步稀释。②每毫升活菌数：按上面公式分别计算3个稀释度的菌数，其计算结果3个稀释度应很接近，如差距较大，实验则不够精确。③菌落类型：简单根据菌落特征，计算3个重复共有几种（一样的算一种）。（7）结果分析：根据两种样品的细菌数量和菌落种类，分析两种环境中细菌的分布有什么不同，这种不同与人群密度、周围环境特点有没有关系。（8）结论。（四）问题与思考1.有时吃剩饭为什么会闹肚子：提示，将新鲜的米饭、放置一天的米饭、放置二天的米饭取一定量，接种在固体培养基上培养后进行计数，比较细菌的数量。还可以将剩饭热后培养进行计数检查，与没热过的进行对比。根据此方法你能设计一些小实验，对食物的保鲜或防止变质提出新的看法吗？2.雨后的空气细菌数量是否减少：雨后，把无菌平板在距离地面一定高度，打开皿盖，暴露一定时间（一般为5～10分钟，如空气洁净，可以适当延长时间），经培养后计算菌落数。与没下雨时的空气进行对比，比较细菌数量有没有差距。一般认为，在5分钟内，100cm2表面上沉降的细菌数量约等于10m2空气中细菌数量。用此方法还可以检查教室、实验室、厕所、花园等处的空气细菌数量，并对实验结果进行分析。想一想，多进行户外活动是否有益健康。3.市售的饮料符合卫生标准吗：日常生活中，经常喝一些饮料如汽水、牛奶、果汁等，这些饮料是否符合卫生标准呢？市售饮料的种类多，而且鱼目混珠。可将你经常喝的几种饮料接种在：（1）普通固体培养基的平板上进行培养，统计细菌数量；（2）接种在伊红-美兰培养基上（参考水中大肠杆菌的检查），检查饮料中的大肠杆菌含量。将检查的结果与生活饮用水标准比较，判断其是否符合卫生标准。[例题]空气中的含菌量是衡量空气质量的指标之一。为了检测学校生物实验室、教室、校长室、小树林四个地方空气中的含菌情况，请利用所提供条件设计一个简单实验。(1)请用100mL量筒、4副培养皿、煮沸过的洗碗水设计取样的实验步骤。(2)请用4支试管、滴管、0.01%亚甲基蓝溶液设计检测的实验步骤。(3)实验结果的预测及分析：_____(4)你所设计的实验检测到的是________细菌的相对数量。〔答案〕(1)①用量筒量取等量的煮沸过的洗碗水分别倒人4副培养皿中。②分别将以上4副培养皿暴露放置于题目所说的4个场所。③静置1-3d后，同时加盖取回。(2)①分别取等量放置过的洗碗水放人4支试管中。②在每支试管内滴加5.10滴0.01%亚甲基蓝溶液，将试管置于温暖处。(3)根据4支试管内洗碗水在相同时间内褪色的程度来判定空气中的含菌量。褪色程度最大的，空气中的含菌量相对最高;褪色程度最低的，空气中含菌量最低。(4)好氧性。16题：基因突变、基因重组和染色体变异的比较基因突变基因重组染色体变异概念基因分子结构发生发生改变控制不同性状的基因重新组合染色体数目或者结构发生改变结果产生新的基因产生新的基因型基因数目或排列顺序发生变化应用诱变育种杂交育种多倍体育种和单倍体育种基因重组,基因突变,染色体变异三者的联系和区别基因重组是指非等位基因间的重新组合。能产生大量的变异类型，但只产生新的基因型，不产生新的基因。基因重组的细胞学基础是性原细胞的减数分裂第一次分裂，同源染色体彼此分裂的时候，非同源染色体之间的自由组合和同源染色体的染色单体之间的交叉互换。基因重组是杂交育种的理论基础。基因突变是指基因的分子结构的改变，即基因中的脱氧核苷酸的排列顺序发生了改变，从而导致遗传信息的改变。基因突变的频率很低，但能产生新的基因，对生物的进化有重要意义。发生基因突变的原因是DNA在复制时因受内部因素和外界因素的干扰而发生差错。典型实例是镰刀形细胞贫血症。基因突变是诱变育种的理论基础。染色体变异是指染色体的数目或结构发生改变。重点是数目的变化。染色体组的概念重在理解。一个染色体组中没有同源染色体，没有等位基因，但一个染色体组中所包含的遗传信息是一套个体发育所需要的完整的遗传信息，即常说的一个基因组。对二倍体生物来说，配子中的所有染色体就是一个染色体组。染色体组数是偶数的个体一般都具有生育能力，但染色体组数是奇数的个体是高度不孕的，如一倍体和三倍体等。23题：41、关于神经内分泌免疫系统调节网络学说现代医学最新的进展表明：人体的生命活动并不是仅仅受神经系统的调节，还要接受内分泌系统、免疫系统的复杂调节和影响。机体神经、内分泌和免疫系统共同形成一个复杂广泛的调节网络，机体内所有细胞、组织无一不受这个网络系统的调节和控制，它们既是这个系统的成员，亦接受这个系统的调节，以适应周围环境的变化，维持机体的正常生理功能，发挥防病和抗病的作用。这就是著名的神经-内分泌-免疫网络学说。神经、内分泌和免疫系统在生命活动中并不是杂乱无章、各自为政的，三者两两之间通过复杂的机制互相作用、互相影响，神经系统是通过神经纤维传达信息的，内分泌因子则是以血液循环为主要的传输渠道，而免疫因子主要以血管、组织液和淋巴管为循行通路，神经内分泌和免疫系统都和心血管系统存在着解剖生理病理上的千丝万缕的联系，当机体内外环境发生变化时，中枢神经系统通过整合神经-内分泌-免疫网络的相互作用调节心输出量及各部分血管的舒缩变化，从而使各器官、组织之间的血流分配能适应机体当时功能活动的需要，心血管系统的反应调节是系统整合方式作用的主要途径。从免疫细胞受体研究进展来看，已经表明，神经系统发生变化，会引起内分泌系统的变化，而内分泌系统产生的各类激素作用于免疫系统，必然引起免疫系统功能的变化，与此同时免疫反应也相对地影响中枢神经系统。比如情绪影响人体中的天然杀伤细胞和T细胞的数量及淋巴细胞的反应性。15题：海洋微生物可进行光合作用海洋微生物──一种喜盐细菌，它体中有细菌视紫质。它能将光线转化成移动电子，成为推动菌体新陈代谢的能量，这也就形成了海洋微生物体内特有的光合作用机制。提示人们将来利用海洋微生物视紫质光合作用产生能量的原理，人类可以制造出生物太阳能电池。（例如热泉生态系统中的生物是以硫化物作用能源物质）真核生物只进行无性生殖的话，也不符合规律，可见适用孟德尔的遗传规律的是有性生殖中的主要类型－－配子生殖，配子生殖的真核为基础的[例6]1977年，科学家在深海中的火山口周围发现热泉。热泉喷出的海水温度超过300℃，并且富含硫化氢和硫酸盐。令人惊奇的是，在这样的海水中，竟发现大量的硫细菌。这些细菌通过氧化硫化物和还原二氧化碳来制造有机物，在热泉口周围还发现多种无脊椎动物，如大海蛤、蟹、管水母、没有口也没有消化道的管居环节动物等。近年来，人们不断在深海发现这样的热泉生态系统。有些科学家认为热泉口的环境与地球上早期生命所处的环境类拟。请根据以上材料回答：(1)上述硫细菌的同化作用类型是(2)与一般生态系统相比，深海热泉生态系统有哪些特殊之处?(3)研究深海热泉生态系统有什么意义?[解析]根据题目材料信息：这些细菌通过氧化硫化物和还原二氧化碳来制造有机物。以H2S为例，则：H2S+O2SO2+能量(化学能)CO2+H2O(CH2O)可见硫细菌为化能自养型生物。(2)深海热泉生态系的特殊之处可从无机环境、生产者类群和生态系的能源等三个方面进行描述。(3)阅读完题干，给人的第一印象是生物的适应性和多样性超出我们的预料，进而对热泉生态系生物的抗高温、高压能力感到迷惑，还有“有些科学家认为热泉生态系的环境与地球上早期生命所处的环境类似”，这难道不是生命起源和生物进化的鲜活材料吗?[答案](1)化能自养型(2)①能源是化学能，不是太阳能②生产者是化能自养细菌，不是绿色植物③无机环境是高温、高压、无光环境，不是常温、常压、有光环境(3)①丰富人们对生物适应性或多样性的认识；②对研究生物抗高温、抗高压的机理有重要价值；③对研究生命的起源和生物的进化有一定意义