微生物脂肪酶的应用及其研究进展

江苏农林职业技术学院毕业设计（论文）SNL/QR7.5.4-3微生物脂肪酶的应用及其研究进展专业生物技术及应用学生姓名彭林班级09生物技术及应用学号0911040442指导教师张小华完成日期2012年５月附1：附3：附3：彭霞:微生物脂肪酶的应用及其研究进展微生物脂肪酶的应用及其研究进展摘要:随着工业催化技术的发展，脂肪酶作为一种重要的生物催化剂现已成为世界研究的热点。文中对微生物脂肪酶的结构、性质以及其在粮油食品加工、生物柴油、有机合成、手性化合物合成及三甘酯结构测定等方面的应用进行了综述和展望。关键词：微生物脂肪酶；结构；催化特性；应用；油脂加工ResearchprogressandapplicationofmicrobeslipasePengXiaDepartmentofBioengineering,JiangsuPolytechnicCollegeofAgricultureandForestry,Jurong,Jiangsu,212400Abstract：Withthedevelopmentoftechnologyofindustrialcatalytic.Asanimportantbiocatalyst,lipasehasbecometheresearchhotspotallaroundtheworld.Thepapersummarizedandprospectedthestructureandthepropertyofthemicrobiallipaseandtheapplicationinthefieldsofgrain,oilandfoodprocessing,biodiesel,organicsynthesis,chiralsynthesisandthetriglyceridestructuredetermination.Keywords：microbiallipase；structure；catalyticproperties；application；oilprocessing目录江苏农林职业技术学院毕业设计（论文）前言……………………………………………………………………………………………11脂肪酶的结构特点…………………………………………………………………………11.1脂肪酶的多样性与保守性……………………………………………………………11.2“盖子”结构…………………………………………………………………………22脂肪酶的催化特性…………………………………………………………………………23脂肪酶的应用………………………………………………………………………………33.1在粮油食品加工中的应用.…………………………………………………………33.2在油脂工业工业中的应用.…………………………………………………………43.3在生物柴油中的应用.………………………………………………………………43.4在有机合成中的应用…………………………………………………………………53.5在手性化合物合成方面的应用………………………………………………………53.6在三甘油脂结构测定中的应用………………………………………………………53.7在医药工业中的应用.…………………………………………………………………63.8在纺织工业中的应……………………………………………………………………63.9在化学品合成工业中的应用…………………………………………………………63.10在其他工业方面的应用.……………………………………………………………74展望…………………………………………………………………………………………9参考文献………………………………………………………………………………………10彭霞:微生物脂肪酶的应用及其研究进展1前言脂肪酶又称三酰基甘油水解酶，是一类主要水解由甘油和水不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯的酯键水解酶，广泛存在于动物组织、植物种子和微生物中，主要制备方法有提取法、化学合成法和微生物发酵法。催化甘油三酯分解成甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸，是一类特殊的酯键水解酶。脂肪酶的来源很多，其中微生物来源的脂肪酶可以催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换及合成等，反应不需要辅酶、条件温和、能耗低、底物原料品质要求低、副产物少，主要用于食品加工、生物柴油制备、生物传感器（酶传感器）、手性药物拆分等领域。由于微生物生长繁殖快，所产脂肪酶种类多，具有比动植物源脂肪酶更广泛的作用pH值和温度范围，且微生物脂肪酶一般都是胞外酶，更适合于工业规模生产和获得高纯度制品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，且在理论研究方面也具有重要意义。随着生物技术的快速发展以及固定化酶技术、界面酶学和非水相酶学研究的突破性进展和一些脂肪酶基因的克隆及在异源系统中的高效表达，已有不少脂肪酶实现了工业化生产，在日常生活和工业生产的各领域将得到越来越广泛的应用。人们对微生物脂肪酶产生了浓厚的兴趣。以下是我对微生物脂肪酶特性及其应用进行了综述，并对其研究前景进行了展望。1脂肪酶的结构特点1.1脂肪酶的多样性与保守性到目前为止，大约2000种脂肪酶及相关酶的非冗余序列被提交到蛋白质数据库，所有已知的脂肪酶没有特征性的相似序列，相反，它们呈现出惊人的多样性。在微生物酯酶及脂肪酶数据库中，脂肪酶被分为16个超家族，39个同源家族[1]。它们的唯一共性是都有一个Gly-Z-Ser-W-Gly（在少数情况下，甘氨酸被其他小的残基取代）的五肽序列；尽管脂肪酶的一级序列不同，但是所有脂肪酶表现为相同的结构框架，即所谓的α/β水解酶折叠，并且它们有相同的催化机制.这种结构的保守性是一种非常有用的工具，可以帮助对新酶进行分类鉴定，即使这些酶没有明显的序列相似性[2]。典型的α/β水解酶折叠的基础是一个位于核心的，几乎是8个平行的β-折叠束构成，其中只有一束β2是反平行的，β3~β8是通过α-螺旋（αA-αF）在折叠的两端连接。此特殊结构为酶的活性位点提供了一个稳定支架———催化三联体。这个三联体包括亲核试剂、酸性残基和组氨酸[3]。多数微生物脂肪酶活性中心为丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸构成的三联体，而白地霉（GeotrichumCandium）和假丝酵母（CandidaCylindracea）等少数脂肪酶活性中心由丝氨酸、谷氨酸和组氨酸构成。具有亲核基团的Ser残基，通常情况下位于β5链之后，酸性氨基酸（如Glu或Asp）残基位于β7后面，而His残基位于β8后面[4]（如图1）。江苏农林职业技术学院毕业设计（论文）10图1典型的α/β水解酶折叠不同来源的脂肪酶空间结构主要差别在于β-折叠束和α-螺旋的数量以及β-折叠角度和α-螺旋的空间排列[5]。1.2“盖子”结构脂肪酶通过与水/底物界面的相互作用来获得不同的构象状态。在关闭构象状态时，“盖子”覆盖在酶的活性位点上，酶难以靠近底物分子，而转变到开放构象状态时，催化通道入口打开.近年来，发现“盖子”的作用不仅仅是调节底物靠近活性位点的大门。“盖子”是两性分子结构，在关闭状态，酶的结构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部，当酶转变到开放状态时，疏水端会暴露出来，隐藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域，引起脂肪酶的构象改变，增加了酶与脂类底物的亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活[6-7]。2脂肪酶的催化特性脂肪酶的催化特性主要包括最适温度与最适pH值、热稳定性、区域选择性等几个方面。微生物脂肪酶一般易溶于水，不溶于乙醇，通常在pH值4.0—11.0之间水解能力较强，部分脂肪酶在pH值3.0时仍有稳定的活性，最适作用温度在30—60℃之间。脂肪酶的区域选择性被成功应用的一个领域是修饰三酰甘油，这些三酰甘油具有3个相关的特性：①区域选择性，脂肪酸在甘油骨架上的位置；②脂肪酸特异性，如特定链长或不饱和脂肪酸；③甘油酯的类型，如单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油。大部分已知的脂肪酶都是1,3位甘油酯键专一性的，并在伯醇位置具有活性，例如：青霉（Penicilliumsp）和米黑毛霉（Mucormiehei）脂肪酶为1位和3位甘油酯键专一水解酶，但也有少量在2位具有活性，可以完全水解为脂肪酸。由于脂肪酸的选择性，脂肪酶可以将中链的酯转化为长链（如将C4变为C8，但很少达到C22），只是转化率不同。在这个性质方面，甚至相同酶的不同亚型也不同。如玫瑰假丝酵母脂肪酶的亚型1主要作用于中链（C8—C10）的底物，亚型3作用于可溶性的短链底物，而亚型2和4则作用于长链分子（C16—C18），另外，脂肪酶应用越来越多的领域是多官能团的选择性酰化，例如，糖类、氨基酸和多肽，尤其在保护彭霞:微生物脂肪酶的应用及其研究进展3和去保护过程中，对新药研发中构建糖类骨架化合物库是必需的。精细化工、制药、农用化学品是脂肪酶其他性质最重要的应用领域，这归功于它对大量底物的立体选择性，它可以使前手性底物和拆分外消旋反应更加容易[7-8]。脂肪酶催化特性还表现为，在油/水界面上其催化活力最大。“盖子”中α-螺旋双亲性会影响脂肪酶与底物在油/水界面结合能力，其双亲性减弱将导致脂肪酶活力降低。由于脂肪酶与油/水界面缔合作用，导致“盖子”张开，活性部位暴露，使底物与脂肪酶结合能力增强，底物较容易进入疏水性通道而与活性部位结合生成酶-底物复合物。界面活化现象可提高催化部位附近疏水性，导致α-螺旋再定向，从而暴露出催化部位.界面存在，还可使酶形成不完全水化层，这有利于疏水性底物脂肪族侧链折叠到酶分子表面，使酶催化易于进行[9]。3脂肪酶的应用3.1在粮油食品加工中的应用脂肪酶已成为粮油食品加工中不可或缺的成分，已经广泛应用于焙烤食品、油脂加工、乳制品以及食品添加剂工业中。在面包生面团中加入脂肪酶可使甘油三酯水解成甘油二酯、甘油单酯和脂肪酸，它能改善面团的流变学特性，增强面团对过度发酵的耐受性，提高入炉急胀能力，增大面包体积，改善面包芯的组织结构和柔软性，且对面包芯有二次增白作用；若与其他酶制剂如葡萄糖氧化酶复配后能够取代化学增筋剂溴酸钾，用于提高面制品的烘焙品质、改善面包质地、延长制品的货架期；对于馒头生产，脂肪酶同样能起到良好的面团调理作用。在油脂加工中，脂肪酶可以催化酯交换、酯化、水解等反应。利用1,3-定向脂肪酶催化油脂进行定向酯交换，将廉价的油脂经过改性而转变成高利用价值的油脂，目前在油脂工业上研究最多也最有研究价值的是类可可脂的生产[10]。此外，脂肪酶还广泛应用于乳制品工业中，主要包括奶粉和奶酪风味的加强、缩短奶酪成熟期、以及奶酪产品的生产、乳脂和奶油的脂解改性等，其中脂肪酶作用于乳脂产生游离脂肪酸，进而形成有挥发性的异戊醛、二乙酰、3-羟基丁酮等呈味物质，改善了奶酪风味，并产生特殊香味[11]。除奶制品外，脂肪酶在瘦肉加工过程中用于去除多余的脂肪及在发酵肉制品中用于改善产品的风味等[12]。目前国内外都有用微生物酶法合成芳香化合物等用作食品添加剂的。L－抗坏血酸棕榈酸酯被广泛用作酯溶性抗氧化剂及营养强化剂。蔗糖月桂酸酯用作食品添加剂具有乳化、抗菌等功能。在茶叶生产中应用米赫根毛霉产生的脂肪酶可减少茶叶中的脂质成分，提升多不饱和脂肪酸的浓度，从而改善茶叶风味。酒精饮料发酵过程中加入一定量脂肪酶可赋予产品类似奶酪的香味。生产无脂肉时脂肪的去除是用脂肪酶来完成的。陈正中等[10]人发现添加微生物脂肪酶可改善发酵香肠品质。另外，利用微生物脂肪酶可选择性地水解鱼油，使鱼油中的n－3系高不饱和脂肪酸（n－3PUFA）含量提高，而n－3PUFA具有预江苏农林职业技术学院毕业设计（论文）10防循环系统疾病和提高记忆力的生理功能。3.2在油脂工业中的应用脂肪酶在油脂工业中的应用非常广泛。在油脂精炼工艺中，由于毛油中含有较高的游离脂肪酸，而酸值是衡量油脂品质的重要指标，因此需要脱酸以提高油脂品质。传统脱酸方法主要是化学碱炼法和物理精炼法，近年来多用生物精炼法。原理：一定的条件