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“设计性实验”项目申请书项目名称从牛奶中分离纯化高产nisin的菌株，并进行菌种的初步鉴定项目负责人李茹一年级、专业2010级药物制剂联系电话13756293700电子邮件387599688@qq.com填表日期2012年10月16日国家级生物实验教学示范中心制表填表说明1、本申请书适用于各门实验课程的设计实验。2、《设计性项目申请书》要按顺序逐项填写。填写内容要实事求是，讲究诚信，不能有雷同；表达要明确、严谨。空缺项要填“无”。3、格式要求：（1）一律用A4纸打印，于左侧装订成册。（2）字体：中文用宋体，英文和数字用TimesNewRoman字体，行距为1.5倍行距。（2）一级标题：标题编排应采用“（一）、（二）、（三）”等依次分级编号，左起缩进2字符，宋体加黑，字号为小四号。（3）二级标题：标题编排应采用“1、2、3、”等依次分级编号，左起缩进2字符，宋体加黑，字号为五号。（4）内容：字号为五号，每段第一行左起缩进2字符。4、“设计性实验”项目每人填写一项。5、参考文献按照国家标准《文后参考文献著录规则》(GB7714-87)要求书写。6、本《申请书》各页不够可自行加页项目名称从牛奶中分离纯化高产nisin的菌株，并进行菌种的初步鉴定经费1500（元）起止时间2012年11月至2012年12月负责人学号姓名年级专业联系电话E-mail34100515李茹一2010级药物制剂13756293700387599688@qq.com一、立项背景和依据（包括研究目的、国内外研究现状分析、研究意义，应附主要参考文献）（一）研究目的目前国内各种食品安全问题层出不穷，化学防腐剂危害人类健康也成为其中一类，为改善和保护我们的食品安全，我国应着重开发天然防腐剂—Nisin（乳酸链球菌素），它是由34个氨基酸组成的活性抗菌肽，是一种天然防腐剂、抑菌剂，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶消化成氨基酸。它不会改变肠道内的正常菌群，不会引起抗药性问题，亦不会与其它抗生素出现交叉抗性，安全有效。目前，国外已经大量生产和应用，而国内的产量却不足以满足我们的需求。本实验将从牛奶中分离纯化高产Nisin的菌株，应用于我国的Nisin生产及应用。（二）国内外研究现状分析自1928年美国的L.A.Rogers等首次报道了Nisin这种抑菌物质以后，人们迅速开展了有关乳链菌肽的研究和应用，Nisin经各国毒理学试验证明是安全、无毒副作用的。1969年联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）确认Nisin为安全、高效、可靠的食品防腐剂，到目前为止已在全世界50多个国家广泛应用。1990年中国卫生部签发的证明指出：可以科学的认定Nisin作为食品防腐剂是安全的。并允许使用。1983年，美国食品药物管理局（FDA）确定Nisin为-公认安全产品（GRAS），并批准使用。欧盟也认定其为天然及安全性(E-234)，Nisin并在欧洲各国广泛使用。可以看出，我国对Nisin的认知较晚，应用则更晚，20年过去了，国内对于Nisin的需求仍旧远大于生产量。因产量不足，应用不广泛，这种安全的防腐剂还不能够在我国人民日常生活食材用品中发挥作用。（三）研究意义Nisin是一种乳酸链球菌素（亦称乳链菌肽）的天然生物活性抗菌肽，能有效地杀死或抑制引起食品腐败的革兰氏阳性菌，如乳酸杆菌、肉毒杆菌、葡萄球菌、李斯特菌、耐热腐败菌、棒杆菌、小球菌、明串球菌、分枝杆菌等。特别是对产生孢子的细菌，如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、致死肉毒芽孢杆菌、细菌孢子等有很强的抑制作用。为提高我国Nisin产量，弥补我国在此领域相比较落后的现状，本实验将利用各种途径选育高产Nisin的菌株，提高Nisin产生菌株的单位产量，对于降低Nisin的生产成本，扩大Nisin的使用范围以及保障我国食品安全有重要意义。（四）主要参考文献1、吉林大学生命科学学院微生物学实验讲义任晓东、胡鑫、张金祥等2、《Nisin产生菌的筛选及鉴定》彭其安，王布匀，蒋磊，程勋武汉科技学院环境与城建学院，武汉4300733、《Nisin产生菌株的筛选及其鉴定》都立辉霍贵成刘芳东北农业大学乳品科学教育部重点实验室哈尔滨1500504、《Nisin的生产、提纯和检测》李增利江苏科技大学生化部，镇江2120045、百度百科等N二、项目研究内容（主要研究内容、拟解决的关键问题、创新点等）（一）项目主要研究内容1、利用含50IU·ml的M17G培养基，从未灭菌的牛奶中分离出Nisin产生菌。2、从分离出的Nisin产生菌株中分离纯化出高产菌株。3、进行生理生化反应，并作革兰氏染色，以进行菌种鉴定。（二）拟解决的关键问题1、牛奶中含有大量的微生物，如何将目标菌株分离出来。2、牛奶样品的稀释度为多大时符合实验要求。3、如何纯化目标菌株。4、目标菌株高产Nisin的生理条件，如最适温度，最适pH，最适菌株的数量等。5、如何设计生理生化反应，将目标菌株准确无误的鉴定出来。（三）创新点1、利用常见易得的原料——牛奶来分离纯化产Nisin菌株，便于进行重复性实验。2、利用生理生化反应以及革兰氏染色来进行菌种的鉴定，准确可靠。3、本实验较容易成功，且周期短，实验成果能很快的应用到实际生产中去，为保障我国食品安全早日发挥天然功效，维护我国人民健康。三、项目实施方案（研究思路、技术路线、研究方法等）（一）研究思路1、筛选：①培养基的配置：M17G培养基：多胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母膏2.5g，牛肉膏5g，乳糖5g，抗坏血酸0.5g，β-磷酸甘油二钠19g，MgSO4·7H2O0.25g1000mlpH值6.8，121℃灭菌15min②样品稀释：取10ml牛奶，加入90ml蒸馏水，混匀，为一号样；从一号样中取10ml，加入90ml蒸馏水，混匀，为二号样；从二号样中取10ml，加入90ml蒸馏水，混匀，为三号样。依次稀释至稀释度为10负10次幂。③倒平板：将液体培养基趁热倒入培养皿中，铺满，静置待凝固。④样品涂布：将样品液均匀地涂布到平板上，每种样品涂布三个平板，再设置一个空白对照平板。做好标记后放入30℃培养箱中倒置培养2天。2、分离纯化高产菌株①培养基的配置：底层琼脂培养基：胰蛋白胨0.8g、酵母粉0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl0.5g、Na2HPO4·12H2O0.2g、琼脂1g，100ml顶层琼脂培养基：胰蛋白胨0.8g、酵母粉0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl0.5g、Na2HPO4·12H2O0.2g、琼脂0.5g，100mlLB培养基：蛋白胨1g、酵母粉0.5g、NaCl1g②发酵培养：将1中9个平板中选择单菌落分离好的平板，将菌落挑出分别置于LB培养基中培养并进行标号。进行发酵。将发酵液取出并用盐酸调pH到2，离心，待用。③效价测定：将配置好的顶层琼脂加热熔化，把枯草杆菌的浓度调成OD600值为0.16。在平板中先铺一层琼脂培养基，待加热熔化的顶层琼脂降温至50℃左右，加入确定量的枯草杆菌，混合均匀，加入已经铺好底层琼脂的平板中，每个平板加5ml。待凝固后打孔。挑出孔内琼脂，往里面加入发酵液上清加平即可，每个菌株对应的发酵液做三组。再做一个空白对照平板。置于培养箱中培养两天。④测量抑菌圈直径⑤绘制标准曲线：因抗菌物质的浓度（对数值）与抑菌圈直径（数学值）呈直线关系，因此根据抑菌圈的大小，可以求出相应的抗菌物质的效价。利用Nisin标准品，配置不同的浓度用琼脂扩散法测量对应的抑菌圈直径，然后绘制标准曲线。将④的实验结果根据标准曲线数据而得出不同菌株的产Nisin的能力大小。进而可以得知高产菌株是哪一株。⑥将选择出的高产菌株进行菌种保藏。并做好标记。及时进行传代。3、生理生化反应（1）淀粉水解实验①固体淀粉培养基灭菌后冷却至50℃,倒平板；②用记号笔将平板分区，不同的区域接种不同的单菌落（2中使用过的菌落），记录接种的菌落标号；③平板倒置在37℃培养24h;④将平板打开，加入Lugol’s碘液，轻旋转，观察结果。（2）糖发酵实验取半固体葡萄糖发酵培养基试管，分别用接种针穿刺接入2中使用过的菌落和阴性对照，37℃培养24h。与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。（3）吲哚实验用接种环分别挑取各个单菌落到含有蛋白胨水培养基的试管中,将试管置37℃恒温培养箱中培养48h。向培养后的蛋白胨水培养基内加3-4滴乙醚，摇动数次，静置3min,待乙醚上升后，沿试管壁缓慢加入2滴吲哚试剂。在乙醚与培养物之间产生红色环状物的，为阳性反应，否则为阴性。（4）V-Ptest（乙酰甲基甲醇试验）以无菌操作分别挑取各个单菌落分别接种于葡萄糖蛋白胨水培养基（V-Ptest）试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中培养。培养2d后，将培养物内加入5-10滴40%KOH,然后加入等量的5%α-奈酚溶液，用力振荡，再放入37℃保温15-30min,若培养物呈红色，为V-Ptest阳性。（5）柠檬酸利用实验挑取菌落分别接种于柠檬酸盐斜面上，置于37℃培养24-48小时。观察柠檬酸盐培养基上有无细菌生长和是否变色，斜面呈蓝色的是阳性反应，呈绿色的为阴性反应。（6）硫化氢产生实验将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别穿刺接种于2支半固体培养基中，置于37℃培养24-48小时。观察结果，如培养基中出现黑色沉淀线者，为阳性反应。4、革兰氏染色制片：取菌种培养液常规涂片，干燥，固定。初染：滴加结晶紫，染色1－2min，水洗；媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min,水洗乙醇脱色：滤纸吸去残水，倾斜玻片用95％乙醇洗涤脱色至无色，立即水洗；复染：番红液复染约2min，水洗；镜检：革兰氏阳性菌（蓝紫色）；革兰氏阴性菌（红色）5、生理生化实验以及革兰氏染色实验完成后，将实验结果绘制成表格，对各种酶类的有无进行分析，与产Nisin菌株的理论生理生化指标进行比对，以确定菌种类型。6、对分离出的高产菌株，生理生化实验鉴定无误后，可进行扩大培养，再从中分离选择更高产的菌株，做重复性实验。而后做应用于实际生产中的条件研究。（二）技术路线1、实验全过程要保证无菌操作，防止杂菌污染。2、实验中每组都进行了对照实验，以对比产生的实验结果。3、及时地进行菌种保藏，以保证实验顺利和进程。4、进行生理生化准确鉴定菌株，增加实验的准确性等。（三）研究方法1、利用加Nisin的选择培养基来抑制杂菌生长，分离出目的菌株。2、利用琼脂扩散法测定乳链菌肽的效价测定，通过比较选择出高产菌株。3、利用设定的生理生化反应鉴定是否为目的菌种。4、将选择出的高产菌株再进行培养，再次分离纯化高产菌株。（四）实施计划2012.11.01—2012.11.09查阅文献，选择实验材料以及设计实验方案2012.11.10—2012.11.11选择牛奶基地2012.11.12---2012.11.13初筛2012.11.14---2012.11.16分离纯化高产菌株2012.11.17---2012.11.20生理生化反应及革兰氏染色2012.11.21---2012.11.23实验结果分析四、拟利用资源（所需仪器设备、实验材料等）（一）仪器设备电热鼓风干燥箱紫外可见分光光度计离心机电子天平酒精灯玻璃器皿（如烧杯滴管培养皿）离心管PE管（二）实验材料多胨大豆蛋白胨酵母膏牛肉膏乳糖抗坏血酸β-磷酸甘油二钠MgSO4·7H2O胰蛋白胨酵母粉葡萄糖NaClNa2HPO4·12H2O琼脂Lugol’s碘液5%α-奈酚溶液乙醚KOH结晶紫番红及配置其他培养基的原料等四、教师评语与成绩实验成绩：指导教师（签名）：年月日