微生物限度检查法操作规程

天津安捷伦药业有限公司微生物限度检查法操作规程第1页共25页执行日期起草部门质量管理部文件编号SOPQC-038-02起草人审核人批准人起草日期审核日期批准日期分发部门：质量管理部1目的：建立微生物限度检查的基本操作，为微生物检查人员提供正确的操作依据。2范围：适用于药品的微生物限度检查。3责任：QC化验员、QC主任。4内容：依据《中国药典2005年版》、中华人民共和国卫生部《药品卫生检验方法》。细菌、霉菌和酵母菌计数1简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的方法，也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。细菌、霉菌和酵母菌计数除另有规定外，均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上最常用的一种方法。以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所生成的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落数均可由一个或多个细菌生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位（colonyformingunity,cfu）不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。在进行本法测定时必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。2仪器、设备2.1设备SOPQC-038-02微生物限度检查法操作规程第2页共25页天津安捷伦药业有限公司2.1.1无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的空气净化系统。2.1.1.1结构和要求见无菌检查法。2.1.1.2操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。2.1.1.3缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。2.1.1.4洁净级别及检查方法通常采用尘粒数和浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测定方法》的现行国家标准进行洁净度验证。洁净级别尘粒数/m3浮游菌（个）/m3沉降菌（个）/（￠90mm·0.5h）微粒直径≥0.5μm微粒直径≥5μm100级≤3，500≤0≤5≤110000级≤350，000≤2000≤100≤3100000级≤3，500，000≤20，000≤500≤10沉降菌数测定（Ⅱ法）无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30分钟，将备妥的营养琼脂平板3个（经30℃～35℃预培养48小时，证明无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30分钟后，将盖盖上。在30～35℃培养箱内倒置培养48小时，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。有条件的单位，同时应检查操作间和净化工作台上的浮游菌和尘粒数，分别应达到10000级和100级。如菌落数或尘粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤器，必要时予以更换。2.1.1.5在每次操作前、后用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台、地面及可能污染的死角，然后启动室内的层流净化装置，同时用紫外灭菌灯照射30分钟。2.1.2阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。2.1.3无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公室等配套设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。2.2仪器SOPQC-038-02微生物限度检查法操作规程第3页共25页天津安捷伦药业有限公司2.2.1恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（23℃～28℃）、微波炉（或其他适宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆仪（3000～8000r/min）、恒温水浴、离心机、电热干燥箱（250℃～300℃）、电冰箱、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定。）、菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平、pH系列比色计。5.2.2.2玻璃器皿、锥形瓶（250～300ml，内装玻璃珠若干；500ml，1000ml）、培养皿（直径9cm）、量筒（100ml，500ml）、试管（18mm×180mm、28mm×198mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20ml或30ml）及针头、载玻片、盖玻片、带盖玻璃消毒缸、带盖不锈钢筒。玻璃器皿用前应用洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。使用过后如与细菌接触，应先灭菌倒出内容物后再清洗，晾干。吸管、量筒应不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用震荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免震荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121℃灭菌30分钟，烘干或160℃干热灭菌2小时，备用。2.2.3用具大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%～75%乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌物品。接种环（白铱金或镍合金，环径4mm～5mm、长度6cm～10cm）、酒精灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、实验记录纸等。3试液、稀释剂和试剂3.1试液3.1.10.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。2.3.1.25%石碳酸溶液或其他适宜消毒液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）。3.1.375%乙醇溶液。3.1.4碘酊或碘伏溶液。3.2稀释剂和试剂3.2.10.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃灭菌20min。3.2.2pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，分装过滤，121℃灭菌20分钟。3.2.3pH6.8无菌磷酸盐缓冲液取磷酸氢二钾6.80g与氢氧化钠0.944g，加水稀SOPQC-038-02微生物限度检查法操作规程第4页共25页天津安捷伦药业有限公司释至1000ml，121℃灭菌20min。3.2.4pH7.6无菌磷酸盐缓冲液取磷酸氢二钾6.80g与氢氧化钠1.70g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20min。3.3试液3.3.1二盐酸二甲基对苯二胺试液取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加水10ml，即得。临用时少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。3.3.2亚碲酸钠（钾）试液取亚硫酸钠（钾）0.1g，加新鲜煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。3.3.3玫瑰红钠试液取玫瑰红钠0.1g，加水使溶解成75ml。3.3.4亮绿试液取亮绿0.1g，加水100ml使溶解。3.3.5盐酸试液取盐酸8.4ml，加水稀释成100ml。3.3.60.1%氯化三苯四氮唑试液（TTC）取氯化三苯四氮唑0.1g，加水溶解成10ml。3.3.7靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。3.3.8碘试液取碘6g，碘化钾5g，加水20ml使溶解。3.3.9过氧化氢试液取浓过氧化氢溶液（30%），加水稀释成3%的溶液。临用时配制。3.4指示液3.4.1中性红指示液取中性红1.0g，研细。加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。变色范围pH6.8～8.0（红→黄）。3.4.2亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。3.4.3酚磺酞指示液取亚甲蓝0.5g，加1mol/L氢氧化钠溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。变色范围pH6.8～8.4（黄→红）。3.4.4溴甲酚紫指示液取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇使溶解成100ml。色范围pH5.2～6.8（黄→紫）。3.4.5曙红钠指示液取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。4.培养基除另有规定外，培养基灭菌条件为121℃20min。4.1营养琼脂培养基与营养肉汤培养基；4.2玫瑰红钠琼脂培养基；SOPQC-038-02微生物限度检查法操作规程第5页共25页天津安捷伦药业有限公司4.3酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）；4.4胆盐乳糖培养基（BL）；4.5培养基制备注意事项4.5.1采用干燥培养基，按照说明配制，应对灭菌后的培养基PH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。4.5.2配制的培养基不应有沉淀。如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。4.5.3培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。4.5.4培养基配制后应在2小时内灭菌，避免细菌繁殖。4.5.5灭菌后的培养基应保存在2～25℃，防止被污染，可在3周内用毕；保存于密闭容器中，可在一年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。4.5.6用水浴或微波炉加热溶化琼脂培养基，勿用电炉直接溶化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏。已溶化的培养基应一次用完，剩余培养基不宜再用。培养基不能反复加热溶化。5.供试品抽样、保存及检验量5.1抽样5.1.1一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3～5倍量（以备复试或留样观察）。5.1.2抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。5.1.3凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。5.2保存5.2.1供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。5.2.2供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。5.3供试品的检验量5.3.1所有剂型的供试品须取自2个以上的包装单位（中药蜜丸须取自4丸、膜剂除须取自4片以上）。SOPQC-038-02微生物限度检查法操作规程第6页共25页天津安捷伦药业有限公司5.3.2固体及半固体（黏稠性供试品）制剂检验量为10g，液体制剂检验量为10ml。膜剂除另有规定外，中药膜剂为25cm2（中药膜剂较厚不宜取量过多），化学及生化膜剂为50cm2。贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减。但除另有规定外，口服固体制剂不得低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。5.3.3要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。6.试验准备6.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀桨杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等经传递窗转移至无菌室。每次实验所用物品必须提前做好计划，准备足够用量，避免操作中出入无菌间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。6.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30分钟。6.3关闭紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、手套、口罩。操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，等干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。7.供试液的制备按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。如使用了乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响。供