心痛宁胶囊对易损斑块大鼠模型ET-1蛋白表达的影响

心痛宁胶囊对易损斑块大鼠模型ET-1蛋白表达的影响1张蕴慧(山东中医药大学，高血压国家中医临床研究基地，济南，250014)【摘要】:目的观察心痛宁胶囊对易损斑块大鼠模型ET-1蛋白表达的影响。方法将48只大鼠随机分为心痛宁高剂量A组，心痛宁中剂量B组，通心络对照C组，空白对照D组，每组为12只。于实验12周时电镜观测易损斑块大鼠模型ET-1蛋白表达。结果用药后心痛宁大剂量组ET-1蛋白表达积分较心痛宁中剂量组、通心络组、空白对照组均有显著性差异，P＜0.05，通心络组较心痛宁中剂量、空白对照组两组比较有显著性差异，P＜0.05，心痛宁中剂量组较空白对照组无显著性差异，P＞0.05。结论心痛宁胶囊能有效降低ET-1蛋白质表达，改善血管内皮功能，稳定易损斑块。【关键词】：心痛宁胶囊；心脏；易损斑块；ET-1血管内皮细胞参与多种与血管有关的生理和病理生理过程，在生理情况下主要通过产生活性物质，来调节血管张力和血管平滑肌功能。内皮素-1（ET-1）是迄今所知作用最强、持续最久的缩血管多肽,动脉粥样硬化病变本身造成冠状动脉狭窄，内皮细胞缺血、缺氧、损伤，引起ET-1的合成、分泌增加，ET-1与其受体相结合，提高细胞内钙离子浓度，从而发挥强大的收缩血管作用，使冠状动脉强烈收缩，导致斑块局部血流动力学不稳定，容易导致斑块破裂，血栓形成。因此本研究探讨心痛宁方对斑块大鼠模型ET-1蛋白表达的影响，从而为临床研究提供更为广阔的思路。1材料和方法1.1实验动物雄性SD大鼠48只，体重180-200g，由山东大学实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK(鲁)20090001。1.2实验药品1.2.1心痛宁胶囊，生药含量：每丸1.25g；胶囊总提取物：每丸含0.5g。由山东中医药大学制药厂提供。原处方组成：黄芪30g、黄精15g、当归12g、川芎10g、肉桂6g、红花6g。1.2.2通心络胶囊，0.26g/粒，石家庄以岭药业有限公司产品,批号：080612。1.3实验仪器本课题为山东省中医药管理局课题（No2500-112），山东省泰山学者专项资金资助项目。张蕴慧，山东济南；通讯地址:文化西路42号山东省中医院心内科；邮政编码:250014；电话:[phone]；手机：[phone]；E-mail:[e-mail]。1.3.1DMM-200C显微镜，由山东中医药大学附属医院病理科提供；1.3.2METTLERAE20型电子分析天平，海特勒-托利多上海仪器有限公司；1.3.3二氨基联苯胺（DAB），购自北京博奥森生物技术有限公司；1.3.44%甲醛溶液，由山东中医药大学附属医院制剂学实验室提供；1.3.5ET-1免疫组织化学试剂盒，购自北京博奥森生物技术有限公司。1.4实验方法1.4.1分组方法将48只大鼠随机分为心痛宁高剂量A组，心痛宁中剂量B组，通心络对照C组，空白对照D组，每组为12只。1.4.2造模方法一次性腹腔注射维生素D360万单位/Kg,高脂饲料喂养6个月。高脂饲料配方：胆固醇3%，胆酸钠0.5%，丙基硫氧嘧啶0.2%，白糖5%，猪油10%，基础饲料81.3%。1.4.3给药方法A组给予浓度为125mg生药/ml的心痛宁胶囊药液灌胃，25ml/Kg/天，1次/天；B组给予浓度为62.5mg生药/ml的心痛宁胶囊药液灌胃，25ml/Kg/天，1次/天；C组给予浓度为20mg/ml的通心络胶囊药液灌胃，25ml/Kg/天，1次/天；D组给予生理盐水25ml/Kg/天，1次/天。1.4.4取材及检测1.4.4.1大鼠ET-1蛋白表达检测采用免疫组织化学法，具体步骤为：石蜡包埋后的组织标本连续切成4μm厚的切片，经脱蜡，梯度酒精水化后，抗原高压热修复。以3％双氧水孵育10min灭活内源性过氧化物酶，5%正常的羊血清室温孵育15分钟，倾去，勿洗。滴加适当比例稀释的一抗，4℃冰箱过夜，PBS冲洗，每次3分钟，共3次。滴加二抗，室温孵育15分钟，PBS冲洗，每次3分钟，共3次。滴加三抗，室温孵育15分钟，PBS冲洗，每次3分钟，共3次。DAB染色，苏木素复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果判断：参照AXIOTIS等标准，由两位病理医生采用盲法(独立检测)在高倍镜(×400)下读片。每张切片随机观察10个不重复的视野(不足1O个视野的，按实际观察到的视野计数)，根据阳性细胞占同类细胞总数的百分率及细胞染色强度综合判定。染色强度评分标准：不着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。阳性细胞所占整张片比例评分标准：阳性细胞数≤10%为0分，10%～4O%为1分，41%～70%为2分，＞70%为3分。两种评分相加，0～1分为(-)，2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。≤2分的定为阴性，＞2分的定为阳性。1.4.4.2取心脏标本用2%戊巴比妥钠0.2ml/100g体重腹腔注射、麻醉，立即开胸，快速分离、摘取心脏、主动脉，置于4%甲醛溶液中，备做免疫组化。1.5统计学分析计量资料数据以均数±标准差（X±SD）表示，数据采用SPSS17.0进行数据处理及相关性分析。所有计量资料均用P＜0.05为差别显著，P＜0.01为差别非常显著。2结果用药后心痛宁大剂量组ET-1蛋白表达积分较心痛宁中剂量组、通心络组、空白对照组均有显著性差异，P＜0.05，通心络组较心痛宁中剂量、空白对照组两组比较有显著性差异，P＜0.05，心痛宁中剂量组较空白对照组无显著性差异，P＞0.05。各组积分见表1：表1各组ET-1蛋白表达积分比较（X±SD）组别心痛宁大剂量组心痛宁中剂量组通心络组空白对照组积分2.17±0.58a4.92±0.79bc4.08±0.79c5.33±0.65注：a：P＜0.05；b：P＜0.05；c：P＞0.05照片附后：图片1心痛宁大剂量组ET-1蛋白表达图片2心痛宁中剂量组ET-1蛋白表达免疫组化染色×400免疫组化染色×400图片3通心络组ET-1蛋白表达图片4空白对照组ET-1蛋白表达免疫组化染色×400免疫组化染色×4003讨论本实验所选的因子ET-1是21个氨基酸组成的血管活性多肽物质，主要由内皮细胞产生[1]。动脉粥样硬化病变本身造成冠状动脉狭窄，内皮细胞缺血、缺氧、损伤，引起ET-1的合成、分泌增加；在冠状动脉粥样硬化部位，ET受体密度约为正常的两倍，ET-1与其受体相结合，提高细胞内钙离子浓度，从而发挥强大的收缩血管作用，使冠状动脉强烈收缩，导致斑块局部血流动力学不稳定，容易导致斑块破裂，血栓形成[2]。此外，ET-1可促进血管平滑肌细胞DNA的合成和有丝分裂，使血管平滑肌增殖，从而加速斑块的形成[3]。在动物试验中也证实，血浆内皮素浓度增加，可导致冠状动脉的阻塞，引起心肌缺血性改变[4]。本研究结果显示，心痛宁胶囊能有效降低ET-1蛋白质表达，改善血管内皮功能，稳定斑块。中药复方制剂心痛宁胶囊具有稳定冠状动脉粥样硬化斑块的效应，通过稳定斑块纤维帽、保护血管内皮功能、干预炎症-凝血网络、抑制血管平滑肌增殖等方面发挥作用，是多环节、多途径的。因此，进行心痛宁胶囊对冠状动脉粥样硬化斑块的稳定作用研究，为中医药温阳益气、活血化瘀理论治疗冠状动脉粥样硬化易损斑块提供了客观实验佐证，也为进一步研发保护冠状动脉粥样硬化斑块的中药制剂提供了客观参考依据，具有较大的学术价值和应用前景。【参考文献】：[1]邢之华，林展增.保心汤对冠心病心绞痛气虚血瘀证血浆内皮素的影响.湖南中医学院学报，2003；23（3）：38-39[2]张现莉.血浆内皮素、血尿酸水平在不稳定型心绞痛中的临床意义.滨州学院学报，2008；31（3）：236-237[3]韩家瑞，周亚滨等.养心汤对不稳定型心绞痛模型家兔血脂及血浆内皮素含量的影响.中国中医药科技，2006；13（3）：163[4]张艳等.益气活血复方对动脉粥样硬化家兔纤溶系统及TF的影响，中国医药指南，2009；21（7）：34-35