心肌型脂肪酸结合蛋白的新近研究进展OK

1关于心肌型脂肪酸结合蛋白的新近研究进展单位:天津北辰区宜兴埠医院作者:苏忠旭（本文文责自负）【摘要】急性心肌梗死（AMI）的发病率及死亡率均很高，现代治疗学认为，AMI发病后能迅速得到确诊并进行再灌注治疗，对于降低死亡率及改善预后十分重要。迄今为止,临床应用的检测指标如肌钙蛋白I(cTnI)、心肌型肌酸激酶同工酶（CKMB），在AMI发病后的早期（２h～４h）阳性率不高；肌红蛋白（MB）虽出现较早,但特异性较差。心肌型脂肪酸结合蛋白（heartfattyacidbindingprotein,H-FABP）是近些年推出的心肌标志物，受到业界重视，本文将对其性质、检测及在心肌损伤中的相关应用作出相应的论述。【关键词】心肌型脂肪酸结合蛋白急性心肌梗死检测应用一.特性1.脂肪酸结合蛋白（FABP）是一种小分子蛋白质（相对分子量为15000），存在于机体多种组织细胞的胞浆中，主要担负着结合脂肪酸并调节其细胞内代谢的功能。按照组织特异性不同可以分为心肌型（H-FABP）、小肠型（I-FABP）、肝脏型（L-FABP）、脂肪细胞型（A-FABP）、脑细胞型（B-FABP）、肾脏型（K-FABP）、骨骼肌型（S-FABP）、牛皮癣相关性（PA-FABP）、表皮型（E-FABP）9种亚型[1]。它们分布于哺乳动物的心肌、小肠、肝脏、脂肪组织、脑、表皮等组织细胞中,，在蛋白质序列上显示有很大的同源性［2］。种FABPs都有不同的表达模式，这些蛋白有多种功能，包括促进细胞摄取和运输脂肪酸，寻找参与特殊新陈代谢途径的脂肪酸，参与基因表达和细胞生长的调节。首先由Ockner等在1972年研究大鼠的小肠脂肪酸吸收的调节时，于肠粘膜发现的一族同源性的小分子细胞内蛋白质。分子量为12～16KD，广泛分布于哺乳动物的小肠、肝、脂肪、心、脑、骨骼肌等多种细胞中。在同一细胞中可分布多种FABPs，例如在小肠内皮细胞上存在两种不同FABPs，即L-FABP和I-FABP，二者具有29％的同源性。在植物中也发现有FABP。不同型FABP的序列有较大的同源性[3]。H-FABP是一种可溶性细胞质蛋白，分子量为14～15KD。它特异、大量存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白的4%-8%，正常人每克湿重心肌中含H-FABP约（0.52±0.06）毫克。H-FABP是一种酸性蛋白质，其等电点（pI）为5.1。人H-FABP的一级结构由132个氨基酸组成，其中还有多个苏氨酸和赖氨酸，缺少半胱氨酸，在其N末端有一个乙酰化的缬氨酸残基。心肌型脂肪酸结合蛋白能够与疏水性配体分子如长链脂肪酸、维生素（视黄醇）、视黄酸、某些有机阴离子等发生特异性结合，是关键的脂肪酸载体蛋白。它可将脂肪酸从细胞质膜向发生酯化和氧化的部位运输，从而进入线粒体的能量代谢体系之中，使脂肪酸在此氧化分解并最终生成三磷酸腺苷（ATP），并提供能量。H-FABP特异地存在于心肌组织中。正常人的血浆和尿中不含有H-FABP，或含量甚少。H-FABP的空间结构与其他亚型相似，都包括2个α螺旋与1个β折叠结构，其2个短α螺旋结构（αⅠ与αⅡ）由肽链N-末端的7个氨基酸组成，β折叠结构则由92个氨基酸构成，分为βA~J8个片层[3]。H-FABP与心肌细胞内作为能源的难溶性长链脂肪酸以及脂酰辅酶A（acyl-CoA）的疏水部分相结合，起着将上述物质从细胞质膜向脂化和氧化部位运输的作用。血流中乳糜微粒和极低密度脂蛋白释放出的脂肪酸通过细胞表面的脂肪酸转运蛋白进入细胞内后，被H-FABP摄取并转运至线粒，从而进入能量代谢体系并最终生成三磷酸腺苷（ATP），为心肌收缩提供能量。二.检测1.夹心酶免法（SandwichELISA）1997年Panteghini等［4］采用9FABP125单克隆抗体和鸡多克隆抗体联合HRP标记的鼠抗鸡IgY单克隆抗体，进行双抗体夹心ELISA法测定HFABP。本法批内CV＜15%，最低检出线0.5μg/L,与其他心肌、骨骼肌蛋白、肌红蛋白、肌浆球蛋白、肌钙蛋白无交叉反应。用该法测定35名健康人血清中HFABP水平为0.5μg/L～2.8μg/L，正常参考值上限为10μg/L。北京大学生命科学院率先在国内完成HFABPELISA法测定试剂的研制工作［5］。Tanaka等[6]建立了血浆和尿中的H－FABP竞争性酶免疫分析2法，但测定需时较长，不适合临床应用。Wodwig等[7]建立了一步法ELISA，测定需时45min，其敏感性和特异性与Okhura等[8]的二步法ELISA一致。此两法现均有商品供应且已用于临床。2.时间分辨免疫荧光测定法（TRIFMA）时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是自80年代以来新发展起来的一种新型分析技术，与其它免疫分析技术相比，有其独特的优点。时间分辨荧光免疫分析具有灵敏度高、特异性强、所用试剂有良好的稳定性、检测限较宽、尤其是能消除常规荧光测定中的高背景等优点，是非放射免疫分析中很有发展潜力的分析方法[9]。服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不稳定的缺点；而且，由于TRFIA法能够很好的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级。正是由于TRFIA的独特优点，使得它成为免疫分析中最有发展潜力的一种分析方法。时间分辨荧光免疫分析的原理就是使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、TritonX-100等成分形成一种微囊。后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。1997年Katrukha等[10]H-FABP单克隆抗体研制出快速而敏感的双抗体夹心一步时间分辨免疫荧光测定法，以F31型单克隆抗体作为捕获抗体，用Eu螯合物标记F12型单克隆抗体作为标记抗体。血清标本和Eu标记抗体依次加入包被有F31单抗的板孔中，于室温培育30min后洗涤，然后加入LANFLA增强液混匀，于时间分辨荧光计上测定荧光强度，其强度值与血清中HFABP含量成正比。本法最低检出线为1μg/L，线性范围1μg/L～300μg/L。用本法检测AMI患者血清HFABP，发现在AMI发作2h～4h内血清HFABP水平就明显增高。3.在线流动替换免疫试验（Onlineflowdisplacementimmunoassay）采用标准流动置换免疫测定分析系统，通过固化抗体以特异结合样本中的抗原而置换标记抗原，借助测定下游标记物的含量即可完成定量测定。Kaptein等［11］利用该系统测量HFABP，置换系统采用反向测定法即利用固化抗原联合酶标记HFABP单克隆抗体系统，以样品中的HFABP置换固定抗原，通过检测酶标记抗体量，即可达到HFABP的快速测定，该法的检测范围为2μg/L～2000μg/L。4.光栅耦合传感器技术（Gratingcouplesenser）1998年Orban等［12］采用重组牛HFABP制备单克隆抗体，并使其共价结合与光栅耦合传感器，制备出新型免疫光栅耦合传感器，进行HFABP特异性免疫反应的动力学分析，测定结果准确可靠，但需特殊设备。5.乳胶微粒增强免疫浊度法（Microparticleenhancedturbidimetricimmunoassay）。1998年,Robers等[13]成功将乳胶微粒增强免疫比浊法引入到H-FABP的检测中,它具有检测精确、快速、易操作以及全自动化等许多优点。研究中采用3种针对不同表位的抗H-FABP单克隆抗体标记乳胶微粒,抗体与相应抗原结合后导致乳胶微粒的凝聚,根据浊度增加的情况计算HFABP的浓度。检测过程只需在10min以内就能完成，检测的最低浓度可达1.1μg/L，这和Wodzig建立的夹心ELISA法相近。批内和批间变异系数（CV）分别为2%～6％和3%～10％；检测范围很大，浓度大于2400μg/L时也不会出现前带现象。整个分析过程可以在临床全自动免疫比浊分析仪上进行,自动化程度高,适用于临床大批量标本的处理，但不能用于全血标本的检测[14]。当今广泛应用于生化分析仪的胶乳增强免疫透射比浊法（PETIA）：以多克隆抗体为基础的改良免疫比浊分析法，利用基因工程方法将抗体与胶乳颗粒结合，当抗原抗体相结合时便形成了抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，增强了反应吸光度，反应液在一定波长处比浊，与同样处理的标准液比较，计算标本中抗原的含量。利用生化分析仪进行比浊测3定，整个分析过程只需几分钟，该方法与传统免疫比浊法比较其灵敏度更高。6.免疫传感器测定法（immunosensorassay）Siegmann－Thoss等[15]建立起夹心法酶免疫分析用葡萄糖氧化酶标记抗体，但试验需将标本预稀释且易发生基质效应。现在多改用实时的光学免疫传感器，但标本用量较多，检测限较高且易受标本中脂类的干扰。Solreiber和Key等[16]建立了阻抗传感器法，只需20min完成测定，结果可与Wodwig等的ElISA法一致，但在低浓度5～15mg/L间的敏感度不够。2002年Reagan等[17]介绍了一种只需50min的全血免疫传感器法。近期又有可连续监测的在线免疫置换传感器问世[18]，用微透析探针取得全血标本或静脉透析血标本的测定结果。测量H-FABP的方法有光栅耦合传感器技术和在线流动替换免疫试验，测定结果准确可靠，但需特殊设备。故目前常用固相免疫层析技术测定H-FABP，所需时间短，准确性较高，容易操作［19］。7.免疫胶体金技术胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。1971年Faulk和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。Watanabe等[20]与2001年研究成功了一种以全血标本作为检测对象的H-FABP定性试纸条。试纸条分为3个区域：样品接收区域、反应区域、检测区域。该试纸条的一大特点是设计了一个固相血浆分离介质用以分离抗凝全血样本中的血浆，这个设计省去了样本良心的步骤，大大缩短了检测时间。可以在15分内定型出结果，操作方便，但是却不能将样本中的H-FABP定量，限制了H-FABP在估计心肌梗死面积以及动态观察进行性心肌梗死方面的应用。2003年Chan等[21]利用一种特殊的读卡器对阳性结果检测扫描出胶体金聚集颜色的密度，由此计算出抗原的浓度