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实验二小鼠原代细胞的分离及细胞计数(一)原理细胞培养(Cellculture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。(二)操作1．取材用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出内脏器官或组织。置于无菌平皿中。2．切割用灭菌的PBS液将取出的脏器或组织清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。3．消化吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化30分钟，每隔5分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清。4．制备单细胞悬液向含有经消化的器官或组织的离心管中加入2-3ml含10%小牛血清的DMEM培养基，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。5．细胞计数1盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。4计算原细胞悬液的细胞数（按照下面公式计算细胞密度）：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而1ml＝1000mm3。(三)结果观察显微镜下的细胞形态，并计算细胞的数目。（四）注意事项1．取材然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。2．制备单细胞悬液向含有经消化的肾组织的离心管中加入2-3mlPBS，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。3．细胞计数如果细胞太浓，要稀释后再进行计数，一般要求细胞浓度在106左右较好。注意：写实验报告，将细胞的形态和数量要记清楚。