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1实验三实验性缺氧【实验目的】1.掌握各型（低张性和血液性）缺氧动物模型复制的方法，了解缺氧的分类。2.观察不同类型缺氧时机体的变化（活动状况、呼吸、粘膜及肝脏的颜色）及存活时间；3.观察不同年龄和中枢兴奋状态对机体缺氧耐受性的影响，理解条件因素在缺氧发病中的重要性。4.掌握各型缺氧的发生机制及特点。5.了解常见血液性缺氧的解救措施。【实验原理】导致低张性缺氧最常见的原因包括吸入气氧分压过低和外呼吸功能障碍。本实验将小鼠放置于加入钠石灰的密闭广口瓶内，随着小鼠的呼吸消耗，广口瓶中氧气含量逐渐降低，模拟外环境氧分压过低引起的低张性缺氧。观察低张性缺氧时机体的变化（活动状况、呼吸、粘膜及肝脏的颜色）及存活时间。影响机体对缺氧耐受性的因素很多，除缺氧时间、速度、类型和程度外，还与缺氧时中枢功能状态和年龄等因素有关。本实验通过应用药物改变小鼠的中枢兴奋状态及选择不同年龄的小鼠，观察不同条件下低张性缺氧小鼠的活动状况和存活时间。血液性缺氧是由于血红蛋白的数量减少或性质改变从而降低血液携氧能力或血红蛋白结合的氧不易释出所引起的缺氧。本实验将复制两种常见血液性缺氧模型：一氧化碳中毒和亚硝酸盐中毒引起的血液性缺氧。一氧化碳可与血红蛋白结合，形成碳氧血红蛋白而失去结合氧的能力，从而导致血液携氧能力降低而引起机体缺氧。亚硝酸钠是强氧化剂，可使血红蛋白分子内二价Fe2+氧化成为三价Fe3+而形成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白同样失去携氧能力而引起血液性缺氧。【实验对象】成年小鼠（性别、年龄、体重近似、雌雄不拘）、新生小鼠【实验药品和器材】3.75%尼可刹米、0.25%氯丙嗪、生理盐水、钠石灰、5%亚硝酸钠、1%亚甲兰、浓硫酸、草酸。缺氧瓶带气压平衡装置、耗氧量测定装置（图1）、1ml注射器、5ml注射器、电子天平、纱布、滤纸、眼科剪、眼科镊、小烧杯、酒精灯、火柴、CO发生装置（图2）、气囊袋。2【实验步骤】1.低张性缺氧（1）取体重接近的成年小鼠2只，称重后分别放入盛有钠石灰（大约4~5g，以双层纱布包裹）的两个缺氧瓶（A瓶和B瓶）中，A瓶不盖胶塞，暴露于空气中，B瓶用胶塞塞紧瓶口。（2）比较观察2只小鼠的活动状况、皮肤（口唇）黏膜和肝脏颜色、呼吸频率（次数/10s）和深度，记录小鼠出现抽搐的时间及存活时间。（3）通过耗氧量测定装置测量低张性缺氧（B瓶）的小鼠耗氧量。（4）计算耗氧率（计算方法见附录）。（5）当B瓶小鼠死亡后，将A瓶中小鼠断颈处死，解剖2只小鼠腹腔，取出小鼠肝脏组织，置于标记的白色滤纸上，比较观察肝脏的颜色。2.不同年龄对缺氧耐受性的影响(1)取成年小鼠和新生幼鼠各1只，将2只小鼠分别放入缺氧瓶内（每瓶均放置纱布包裹的钠石灰5g），盖上胶塞。(2)观察小鼠的活动状况、皮肤（口唇）黏膜和肝脏颜色、呼吸频率（次数/10s）和深度，记录小鼠出现抽搐的时间及存活时间。表一、低张性缺氧各项指标变化及不同年龄对低张性缺氧耐受性的影响分组活动状况黏膜颜色呼吸耗氧率抽搐出现时间（s）存活时间（s）肝脏颜色正常对照（A组）低张性缺氧（B组）新生幼鼠组33.不同中枢状态对缺氧耐受性的影响(1)取成年小鼠3只（A、B、C组），称重并标记编号后分别作如下处理：A组小鼠腹腔注射3.75%尼可刹米溶液0.08ml/10g；B组小鼠腹腔注射0.25%氯丙嗪溶液0.1ml/10g；C组小鼠腹腔注射生理盐水0.1ml/10g。(2)腹腔注射结束后迅速将3只小鼠放入缺氧瓶中（每瓶均放置纱布包裹的钠石灰5g），盖上胶塞；(3)比较观察3只小鼠的活动状况、皮肤（口唇）黏膜和呼吸频率（次数/10s）和深度，记录小鼠出现抽搐的时间及存活时间。表二、不同中枢状态对低张性缺氧耐受性的影响分组缺氧前活动状况、呼吸、唇色缺氧时活动状况、呼吸、唇色出现抽搐的时间（s）存活时间（s）尼可刹米组氯丙嗪组生理盐水组4.CO中毒性缺氧（1）取草酸3ml加入CO发生装置试管内，再加入浓硫酸2~3ml，塞紧试管。点燃酒精灯置试管下缓慢加热可见试管内有气泡产生即可，将CO发生装置连接气囊袋收集产生的CO备用。（2）取成年小鼠2只，分别将其放入缺氧瓶（每瓶均放置纱布包裹的钠石灰5g）中，观察其正常表现后，用注射器从气囊袋中抽取5mlCO注入一缺氧瓶中，并迅速盖上胶塞，另一缺氧瓶不盖胶塞。（3）观察小鼠的活动状况、皮肤（口唇）黏膜和呼吸频率（次数/10s）和深度，当小鼠出现抽搐时立即取出小鼠（注意盖好胶塞）并迅速置通风处，观察小鼠各项指标是否恢复。若指标恢复，继续将小鼠放回缺氧瓶中盖上胶塞直至死亡，记录存活时间。（4）解剖CO中毒小鼠的肝脏，观察记录其颜色变化。2.亚硝酸钠中毒性缺氧（1）取成年小鼠2只，称重，观察其正常表现后，腹腔均注射5%亚硝酸钠溶液0.1ml/10g后，一只小鼠立即腹腔注射1%亚甲兰0.1ml/10g，另一小鼠立即腹腔注射生理盐水0.1ml/10g。（3）观察小鼠的活动状况、皮肤（口唇）黏膜和呼吸频率（次数/10s）和深度，并记录小鼠存活时间。（4）解剖亚硝酸盐中毒小鼠的肝脏，观察记录其颜色变化。4表三、血液性缺氧小鼠各项指标变化分组活动状况、呼吸、唇色出现抽搐的时间（s）存活时间（s）肝脏颜色正常对照组CO中毒组亚硝酸盐中毒组亚硝酸盐中毒解救组【实验注意事项】（1）复制低张性缺氧时，要求缺氧瓶必须密闭，必要时可在瓶口涂上凡士林达到密闭效果。（2）各组小鼠体重要求接近，体重差不得超过4g。（3）小鼠腹腔注射时应从左下腹斜向上进针，以免导致肝脏损伤，同时也可避免将药液注入肠管、膀胱和血管内。（4）复制CO中毒性缺氧时CO注射量不宜过多，以免动物迅速死亡而致血液颜色变化不明显，影响结果观察。（5）给动物注射亚甲蓝的剂量要求适当，剂量过少达不到抢救NaNO2中毒的目的；剂量过大反而会加重NaNO2的中毒作用。（6）CO是毒性较强的气体，实验过程中要注意防护。建议实验室窗户打开通风。【思考题】（1）低张性缺氧时小鼠的呼吸、口唇皮肤粘膜颜色为什么会发生改变？其机制是什么？（2）结合实验结果思考不同中枢功能状态对缺氧耐受性影响的机制。（3）相同缺氧条件下为什么对新生鼠和成年鼠的存活时间不一致？（4）不同类型缺氧对呼吸功能的影响有何异同？（5）各种类型缺氧口唇、皮肤、血液颜色有何变化？产生这些变化的机制是什么？（6）CO是通过什么机制降低血红蛋白的携氧能力的？【附录】1.CO产生原理实验中应用CO发生装置产生CO是向草酸中加入一定比例的浓硫酸后，经适当加热而产生的。其反应原理如下：5H2SO4HCOOHCO+H2O△2.钠石灰的作用缺氧瓶内加入钠石灰的目的是吸收小鼠呼出的CO2，使瓶内环境为单纯性低张性缺氧。试剂型钠石灰为粉红色颗粒状物质，其吸收CO2的反应式如下：NaOH•CaO+CO2→Na2CO3+H2O3.亚甲蓝的作用机制亚甲蓝(mgthyeneblue)又称美蓝或甲烯蓝，是一种碱性染料。其氧化型呈蓝色，还原型为无色。适当剂量亚甲蓝可作为亚硝酸盐中毒时的抢救药物。机制是当氧化型亚甲蓝进入机体后可接受还原性辅酶Ⅱ传递的氢离子而转变成为还原型无色亚甲蓝，而无色亚甲蓝能够迅速使高铁血红蛋白转化为正常血红蛋白，在此过程中，无色亚甲蓝又被氧化成为亚甲蓝，如此反复循环，达到解毒作用。但必须指出，亚甲蓝本身是一种氧化剂，因此它也是高铁血红蛋白形成剂，如果应用剂量过大，还原性辅酶Ⅱ不能很快将其全部还原为无色亚甲蓝，那么氧化型亚甲蓝会促进更多高铁血红蛋白的形成而加重病情。因此，应用亚甲蓝治疗抢救高铁血红蛋白血症时，使用剂量一定要适当，切忌大剂量应用。4.小鼠耗氧率的测定（1）测定原理：在密闭缺氧瓶有限的空间内，小鼠不断消耗氧气和呼出CO2，后者被钠石灰吸收，随着氧分压的逐渐下降，使缺氧瓶内形成负压，当把缺氧瓶橡胶管与测氧装置的刻度移液管连通并打开螺旋夹后，移液管内液面因为瓶内负压吸引而上升，其液面从“0”参考点上升的毫升数既该小鼠消耗的氧量（见图1）。（2）方法与步骤1)量筒内加入约2/3高度的水，插入刻度移液管，移液管一端与缺氧瓶连接胶管连通。2)当移液管中液体达到平衡位置时记下“0”参考点。3)测定时将缺氧瓶与移液管连通后，开启螺旋夹待移液管液面上升稳定后，从“0”参考点读出液面上升的毫升数，即为小鼠的总耗氧量，或称耗氧体积（ν）。（3）耗氧率计算根据小鼠体重（m）和存活时间（t），按下式计算小鼠耗氧率（R）：R=v/m×t-1