尾叶桉叶绿体DNA1

高盐低pH值法提取尾叶桉叶绿体DNA的研究一、目的：探究尾叶桉叶绿体DNA（chloroplastDNA，cpDNA）的提取方法，采用高盐低PH法或改良高盐低PH法提取尾叶桉组培苗、绿色愈伤组织和幼嫩叶片的cpDNA，并镜检和荧光显微观察完整叶绿体纯度及完整性、分光光度计检测提取物cpDNA的A260/A230和A260/A280、琼脂糖凝胶电泳检测cpDNA的质量（纯度、得率、电泳条带分布、有无拖尾现象、明暗度）、PCR技术检测能否扩增出目标片段，以期初步探究出适合提取尾叶桉cpDNA的方法及优化提取工艺为尾叶桉叶绿体基因组结构、功能等方面的深入研究奠定基础。[还可选用限制性酶切检测]二、原理：1、实验由三步组成：（1）高盐低PH法提取纯的完整叶绿体（无组织残渣、细胞壁、细胞核和其他细胞器、RNA、核DNA、线粒体DNA污染，不可加蛋白酶否则裂解了叶绿体），并镜检和荧光显微观察完整叶绿体纯度及完整性；（2）提取cpDNA（可参考SDS、CTAB法等）：裂解叶绿体膜（SDS、CTAB、β-巯基乙醇、DTT等蛋白变性剂能溶解胞膜蛋白而破坏细胞膜）、二价金属离子螯合剂EDTA保护DNA（抑制DNase）、添加RNase降解叶绿体RNA、蛋白酶酶解蛋白、酚及氯仿抽提除蛋白、脂质；（3）检测提取物2、cpDNA提取方法比较目前用于高等植物叶绿体DNA提取的方法主要有DNaseI法、蔗糖密度梯度离心法、Percoll梯度法、无水法、高盐低pH法等。传统提取高等植物cpDNA的方法有蔗糖密度梯度离心法、氯化铯密度梯度离心法和无水法等，但它们都有不足，或得率较低，或纯度不高，而且都费时，不易操作。利用高盐低pH法提取茶树cpDNA具有操作简便、用时短、得率较高等优点。蔗糖密度梯度法提取cpDNA时，密度梯度液不易保持，需要配备水平转头高速离心机，利用普通水平离心机和高速角转离心机代替水平转头高速离心机对叶绿体粗提液进行离心，分层效果均不理想，主要是因为普通水平离心机无法提供足够的离心力，而高速角转离心机无法保持蔗糖密度梯度与蔗糖密度梯度液相比，Percoll密度梯度液更容易保持，且可以使用普通水平离心机，离心时间短，分层效果好，但Percoll分离液价格高，且得到的叶绿体层窄。（参考网价：620元/100ml，价格昂贵，消耗大，不宜大量使用）DNaseI法容易导致cpDNA得率低下。高盐低pH法：实验材料高速匀浆时会产生大量静电，未与蛋白质解聚的染色质或核DNA由于静电相互作用吸附到叶绿体膜上，高离子强度介质介入，阻碍了叶绿体膜吸附核DNA提取cpDNA时，吸附于cpDNA上由酚类物质氧化而来的醌类物质极难除去，在缓冲液中加入抗氧化剂，如抗坏血酸-巯基乙醇等，能有效阻止酚类物质氧化，可提高cpDNA的质量。可用DTT代替常用的β-巯基乙醇，DTT和巯基乙醇作用相似，但DTT的刺激性气味小毒性低。为了减少核DNA污染，本研究在叶绿体裂解之前，用DNA消化酶37水浴处理叶绿体溶液，再用EDTA终止酶解，有效的减少了核DNA污染。三、材料：尾叶桉组培苗、绿色愈伤组织（2—4个月）、鲜嫩叶片（选用）四、仪器：剪刀、匀浆机、台式离心机、离心管（50mL）、微量可调移液枪、恒温水浴锅、显微镜、荧光显微镜（胡木林老师实验室）、分光光度计（A260/A280值）、核酸和蛋白分析仪、电泳仪（琼脂糖电泳检测）、PCR五、试剂提取叶绿体：匀浆：缓冲液A（50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，1.25mol/LNaCl，0.25mmol/LVc，1.5%PVP，PH：3.6）缓冲液B（50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，1.25mol/LNaCl，0.25mmol/LVc，10mmol/Lβ-巯基乙醇，0.1%BSA即牛血清蛋白，PH：8.0）缓冲液C（7mmol/LEDTA-Na2，40mmol/L蔗糖，50mmol/LTris(pH8.0)，0.1%BSA，PH8.0）MgCl2，DNaseI，EDTA缓冲液D（50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，1.25mol/LNaCl，2.0%SDS，PH8.0）5mg/mL蛋白酶KTris饱和酚氯仿∶异戊醇(24∶1)无水乙醇3mol/LNaAc溶液（PH5.2）70%乙醇TE缓冲液（PH8.0）：10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，3mol/LNaAc（PH5.2）10mg/mLRNaseA六、实验步骤尾叶桉叶片材料预处理取健康发育近乎完全而鲜嫩的尾叶桉叶片于车载冰箱中带回实验室，采回的尾叶桉叶经蒸馏水冲洗干净，在滤纸上吸干水分，每个样品称约20g用纱布包裹于4℃冰箱黑暗处饥饿处理48h（或放入保鲜袋内，置于－80℃的低温冰箱中保存备用）。材料处理匀浆/液氮取20g饥饿处理后的尾叶桉叶片去中脉，剪成1cm长的小条放入匀浆机中，加入100mL预冷（4℃）的缓冲液A。取20g饥饿处理后的尾叶桉叶片，去中脉，剪成1cm长的小条，研钵中加液氮，迅速研磨几下后，转入预冷的100mL缓冲液A（4℃）匀浆。匀浆速度、时间先低速（3000r/min）匀浆2次，每次10s；再高速（8500r/min）匀浆2次，每次30s。匀浆液经6层纱布过滤完毕后挤出残留的液体，再用6层纱布过滤，将滤液分装于50mL离心管中5000r/min匀浆3次，分别为10s、15s、20s。匀浆液经6层纱布过滤完毕后挤出残留的液体，再用6层纱布过滤，将滤液分装于50mL离心管中低温差速低速离心弃沉淀去残渣、细1000g10min4℃下200×g离心5min，小心移上清液到另一离心管4℃，1220r/min，离心20min，取上清，重复一次（通过公式计算，1500g离心5至10min,去上清（非差速离心）400g6min去上清（非差800Xg离心6in600g（r10cm，2300r/min）（加了山梨1000g离心20min取上清500g离心10min后，弃上清避免过度匀浆及产生泡沫。细胞生物学实验是5000r/min匀浆1min，所以匀浆速度可能要根据仪器方面改。离心（4℃）胞核为169g）速离心）醇）高速离心弃上清得粗叶绿体无（线粒体20000g20min）1500×g离心10min，去上清夜,保留绿色沉淀颗粒，避免光照(防止淀粉聚集)4℃，5110r/min，离心20min，弃上清（通过公式计算，为3000g）2000g（r10cm，4300r/min）（加了山梨醇）3000g离心6min弃上清文献细胞生物学课本P64《香蕉叶绿体分离及叶绿体DNA提取方法》龙兴《枣叶绿体基因组DNA提取方法研究》杨晓婷《桑树叶绿体基因组DNA的提取及部分序列分析》赵卫国《用改进的高盐低pH法分离和纯化棉花叶绿体及叶绿体DNA》刘少林《高等植物叶绿体DNA提纯方法的改进》龚小松《水稻叶绿体DNA提取和纯化方法优化》欧立军《泡桐叶绿体游离及其ＤＮＡ提取方法的筛选》王杨《苜蓿叶绿体DNA的提取及其Rbcl基因片段的克隆》朱海林不同植物叶绿体大小、是否积累淀粉或酶类及积累多少、湿重值不同。离心机转速的换算：RCF（g）=r×11.18×10-6×（rpm）2注：RCF（g）就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。r是以cm计算，是指有效离心半径，即从离心机轴心到离心管桶底的长度旋转半径。大部分文献仅标注离心速率，无有效离心半径r。而标注了离心力的不同文献差别又很大，有待改进。叶绿体纯化1（重复离心）50.00mmol/LTris25.00mmol/LEDTA1.25mol/LNaCl10.00mmol/Lβ-巯基乙醇0.1%BSA即牛血清蛋白pH8.0加入25mL预冷（4℃）的缓冲液B，用无菌软毛笔轻悬，1500g离心15min弃上清叶绿体纯化2DNaseⅠ法（有无DNA酶处理的影响）DNaseⅠ法用2mLC液悬浮沉淀，同时加入MgCl2(终浓度20mmol/L)和DNaseI(终浓度100ug/mL)置于冰上，45min后加入EDTA(终浓度为25mmol/L)终止反应，静置8~10min，终止酶解补充预冷（4℃）的缓冲液C至25mL，1500g离心15min弃上清预冷（4℃）的缓冲液C至25mL，1500g离心15min弃上清镜检叶绿体1、完整性2、纯度（有无杂质污染）3、个数平均值普通光学显微镜1、叶绿体提取液20μL滴在载玻片上，置于40×镜下进行观察计数叶绿体个数2、完整性，杂质，拍照荧光显微镜3、完整性，杂质，拍照裂解叶绿体及提取cpDNA裂解叶绿体加入10mL缓冲液D，然后加入80μL5mg/mL蛋白酶K（终浓度200μg/mL即可），剧烈摇匀，变温处理，即先在50℃条件下温育1h,接着在37℃条件下温育1h《一种优化的大白菜线粒体DNA提取方法》李振兴对照：1、37℃2h2、65℃2h3、50℃2hTris饱和酚抽提加10mL饱和酚（等体积），小心颠翻摇匀5min，10000g离心10min，取上清液氯仿异戊醇抽提（除蛋白、脂质）加入10mL（等体积）氯仿∶异戊醇(24∶1)，小心颠翻离心管5min，10000g离心10min，转移上清液，同上方法反复抽提至界面干净无水乙醇沉淀DNA加入20mL（2倍体积）－20℃预冷的无水乙醇，再加入1/10体积的3mol/LNaAc溶液（PH5.2），混匀后－20℃静置2h，4℃，15000g离心10min，回收DNA70%乙醇去盐沉淀用70%乙醇洗2次，倒去乙醇，室温干燥除RNA加800μLTE缓冲液和10μL10mg/mL的RNaseA，37℃下反应2-4h氯仿抽提2次加入10mL（等体积）氯仿∶异戊醇(24∶1)，小心颠翻离心管5min，10000g离心10min，转移上清液重复步骤上清加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，混匀后加入2倍体积的－20℃预冷的无水乙醇，15000g离心10min，弃上清，用75%乙醇漂洗1次，室温干燥，沉淀溶液于100μLTE缓冲液中，－20℃保存备用。注：红色标记为对比或选用，绿色为比较有可行性的步骤尾叶桉组培苗愈伤组织七、研究现状采用高盐低PH法或改良高盐低PH法提取cpDNA取得最优或良好效果的有：1、茶树——茶树叶绿体DNA提取方法研究（陈春梅）、2、香蕉——香蕉叶绿体分离及叶绿体DNA提取方法（龙兴）、3、枣叶——枣叶绿体基因组ＤＮＡ提取方法研究（杨晓婷）、4、小麦——小麦叶绿体DNA提取方法研究（侯典云）、5、杨树——杨树叶绿体分离及叶绿体DNA提取方法的研究（崔彬彬）、6、棉花——用改进的高盐低pH法分离和纯化棉花叶绿体及叶绿体DNA（刘少林）7、高粱叶片——栽培高粱叶绿体DNA的酶切片段分析（刘欣）8、栓皮栎、9、Milligan法：桑树等等效果不好、达不到标准的有：泡桐，等综合优化的文献：水稻叶绿体DNA提取和纯化方法优化——欧立军总结：采用高盐低PH法是目前提取cpDNA的一种常见、简便方法，但实际应用于各植物时往往要根据情况改进方法（如香蕉含糖量多，棉花含酚多，原高盐低PH提取效果极差，改良效果好）。《高等植物叶绿体DNA提纯方法的改进》（龚小松）是国内最早的文献，被多篇文献参考。《水稻叶绿体DNA提取和纯化方法优化》欧立军、《用改进的高盐低pH法分离和纯化棉花叶绿体及叶绿体DNA》、《小麦叶绿体DNA提取方法研究》侯典云等被引多次。《杨树叶绿体分离及叶绿体DNA提取方法的研究》（崔彬彬）：实验步骤清晰，其中的如何确定有无核污染的检测方法也值得参考。八、要点在抽提过程中，各项操作均温和进行，避免剧烈振荡和过度搅拌，转移DNA的吸头也剪去了尖部，以扩宽管口。为了防止DNase的降解作用，提取时所用的器具、研钵、离心管、溶液等都经过了高压灭菌。同时在提取液中加人了二价金属离子鳌合剂EDTA来消除外源及内源DNase活性。选用发育近乎完全而鲜嫩的叶片，因为过嫩的叶片中蛋白质、糖类含量多，不利于DNA的较好抽提。而过老的叶片表面蜡质层较厚，不利于充分研磨破碎细胞以完全地释放出