层析技术在生物医药及食品中的应用

层析技术在生物医药及食品中的应用摘要层析分离技术作为一种天然产物精制技术，其不但分离能力、选择性、通用性均高，且在食品及生物领域显示出极大的应用潜力。本文综述亲和层析技术在食品及生物医药领域的应用进展情况。关键词：层析技术食品生物医药应用AbstractChromatographyseparationtechnologyasakindofnaturalproducts,refinedtechnology,notonlytheseparationability,highselectivity,generality,andinthefieldoffoodandbiologicalshowspotentialapplications.Inthispaper,affinitychromatographytechnologyinfoodandapplicationprogressinthefieldofbiomedicine.Keywords:Tomographictechniquesfoodbiomedicalapplications1引言层析本身是由植物天然产物分离纯化发展出来的，其起源是在1903年由俄国的植物学家Tswett首先以碳酸钙作为固定相，在玻璃柱上将叶绿素、叶黄素和胡萝卜素进行了分离[1]。它是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用的能力不同，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的[2]。按其原理可分为分为：高效液相层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。层析分离技术是目前应用最广的一种天然产物精制技术，它具备了较高的分离能力、选择性、通用性而成本相对较低，操作条件温和[3]，因而显示出巨大的潜力，在食品及生物领域中一些活性物质的分离纯化方面起着至关重要的作用，尤其是蛋白质的分离纯化，也正因此而备受关注。本文将着重综述亲和层析技术在食品及生物医药领域的应用进展情况。2亲和层析技术在生物及医药领域的应用进展亲和层析是60年代发展起来的一种高效、快速蛋白质分离纯化技术。其原理是利用蛋白质分子与某一分子专一可逆结合的生物特性,来选择分离目标蛋白质。亲和层析容量大,分离效率高,且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用。层析技术在生物制药中主要应用于药物的鉴定和纯度检查;药物中微量杂质的分离和鉴定;药物的降解率和降解产物的测定;制剂中药物的鉴定及其含量测定;制剂中降解产物的测定,分离供毒性试验的物质;对小剂量处方中药物,检测含量的均匀性;测定体液中药物和代谢物的浓度,以便确定药物在体内的吸收,生物利用度和消除；分析药物及杂质);药物生产原料的鉴定和纯度测定。层析技术在需要捕获小型质粒DNA或病毒的大规模生产中特别有优势。在基因治疗载体的纯化方面，膜层析日益被认为是一项可行性技术。膜层析可有效地去除模型病毒，比如猪细小病毒、甲型肝炎病毒、鼠白血病病毒和伪狂犬病病毒。随着染料配基、人工定向合成配基的应用和配基偶联技术的发展,亲和层析技术更加适用化[4]。由于任何蛋白质都具有抗原性,通过杂交瘤技术均可制备相应的特异性单抗,以单抗为亲和配基,去分离对应的目标蛋白质,可以实现各种天然、重组蛋白质的高效、快速分离纯化。近年来,随着人们对蛋白质分子结构的深入研究和其它学科的发展,又出现了一些新的蛋白质层析方法,如金属螯合层析、层析聚焦等[5,6]。现将从生物特性亲和及人工配基亲和两大方面进行概述。生物特异亲和层析法包括免疫亲和层析、凝集素亲和层析、核酸亲和层析等，另外还有以酶或底物为配基的亲和层析或以粘附蛋白或受体蛋白为配基的亲和层析，其特点是配基为生物分子。免疫亲和层析是利用抗体与其相应抗原的作用具有高度的特异性和高度结合力的特点，用适当的方法将抗原或抗体结合到层析载体上，便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。Li等用吸附层析结合免疫亲和层析的方法分离纯化得到一种蛋白复合体，该复合体含有调节转录的辅阻遏物蛋白SMRT和N一coR[7]。单克隆抗体技术的出现极大地推动了免疫亲和层析技术的发展。只要得到特定单抗，利用其作为配基，通过亲和层析，即可从复杂的混合物中分离、纯化特定抗原成份1992年，Lorcnzen将抗病毒性出血败血病病毒(VHSV)的单抗作为亲和配基，经免疫亲和层析法纯化该病毒的四种结构蛋白[8]。凝集素亲和层析适合对一些寡糖或糖肤进行结构分析，其具有特异、敏感、快速的特点。凝集素是一类糖结合蛋白，最先是由植物中分离到的，它可与蛋白的寡糖部分特异结合。因为不同的凝集素能够特异地结合某种寡糖或者糖肤，使得凝集素成为糖链结构分析的一种常用工具[9-11]。目前常用于亲和层析的凝集素主要有麦胚凝集素(wGA)和伴刀豆凝集素A(ConA)。麦胚凝集素特异结合B一N一乙酞葡萄糖胺和唾液酸，伴刀豆凝集素A特异结合a一甘露糖、a一葡萄糖和a一N一乙酞葡萄糖胺。另一种较为常用的是对乙酸氨基葡萄糖专一的曼陀罗凝集素，可用于多巴胺D一受体的提纯[12]。沈国光等应用植物凝集素亲和层析结合离子交换和银环蛇毒素亲和层析分离纯化了作银环蛇神经毒素结合蛋白，为进一步分析、鉴定大鼠隔肌的你银环蛇毒素结合蛋白的结构和功能奠定了基础[13]。核酸亲和层析被认为是目前分离多聚核普酸及其结合蛋白的最有力方法，含有特异寡核普酸的亲和树脂能用于某些酶的分离，Locke等把双链DNA接到纤维素上，有效地纯化了链霉菌脱氧核糖核酸酶[14]。除了上述生物特性亲和层析外，人工配基亲和层析也有着较广泛的应用。人工配基亲和层析也称为通用配基亲和层析，是指利用一些人工配基对不同的蛋白质有亲和性的特点，通过亲和层析来纯化这些蛋白质的方法。主要包括金属鳌合亲和层析和染料配基亲和层析等。金属鳌合亲和层析(MCAC)是近30年来出现的一种亲和层析技术，也称固相化金属离子亲和层析。金属鳌合亲和层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点。由于该方法几乎对蛋白质本身的生物活性没有依赖，所以，除了可以在常规的非变性条件下进行纯化外还特别适合分离纯化变性蛋白，尤其是带6个组氨酸标签的重组蛋白广泛应用于大肠杆菌表达包涵体蛋白质的分离及纯化[15]，是分离纯化生物工程蛋白质产品最有效的工具之一。Ueda等应用Ni离子亲和层析，之后结合分子筛层析，分离纯化了大肠杆菌表达的人催乳素。分别经聚丙烯酞胺凝胶电泳、等电聚焦电泳以及质谱洲ALDI一TOF一MS)和高效分子筛层析鉴定分析，纯度达到99%。经NbZ细胞增殖活性分析，该重组蛋白的生物活性达40.9Iu/mg[16]。染料亲和层析是1968年Haeekel和oppersehlager分别偶然发现的。他们发现蓝染料和磷酸化激酶有专一性作用，并成功地应用于纯化酵母中磷酸激酶。染料配体亲和层析具有蛋白结合容量大，是天然配基蛋白质结合量的10一100倍，配基偶联方法简单，易于操作，蛋白质洗脱容易，适于大规模应用[17]。3亲和层析技术在食品领域的应用食品安全问题是一个全球话题，近年来，国际上食品安全恶性事件频频出现，造成了巨大的经济损失。目前,食品安全主要出现在包括农药残留、兽药残留、有机污染物、添加剂、生物毒素、人畜疾病病原体等方面。因此开发出能够满足要求的快速、方便、准确、灵敏的食品安全分析检测技术是当前迫切需要进行的[18]。免疫层析技术（ImmunochromtogaphicAssay,ICA）[19]是上世纪八十年代初发展起来的一种新型免疫检测技术，结合了免疫标记技术与层析技术的优势，具有快速、简单、低廉、操作时间短、可用于现场筛查等优点，目前被广泛应用于临床诊断，环境污染，食品安全检测以及其他新兴领域。根据免疫标记物的不同可将免疫层析技术分为胶体金免疫层析技术、荧光微球免疫层析技术、荧光乳胶免疫层析技术、上转换发光免疫层析技术、量子点免疫层析技术、基于时间分辨荧光免疫分析技术及磁珠免疫层析技术等。胶体金标记免疫层析技术是一种发展较为成熟的标记技术。但是,降低检测过程中出现假阳性或假阴性、提高检测的灵敏度及可重复性依然是亟待解决的问题[30]。量子点以其优越的荧光强度和稳定性成为一种理想的标记免疫层析探针,故开发具有高通量、选择性好、检测简便的量子点标记免疫层析技术是当前研究者的重要任务。上转化发光材料的低毒、稳定、成本低等特点成为最有潜力的标记免疫层析技术之一,但是该技术在食品中农药、兽药、违禁物品等残留方面研究较少。其基本原理是基于检测样品溶液借助毛细管作用，在条状固相纤维层析材料上迁移，由于样品中的待测物与层析材料上一定区域内的受体（抗体或抗原等）发生了高特异性的免疫反应，形成的免疫复合物被截留和富集在这一区域。通过显色反应，肉眼或仪器短时间内可判读结果。真菌毒素广泛存在于农产品等食品中，亦对人体健康和农业生产带来巨大的影响。目前胶体金免疫层析试纸条在真菌毒素检测方面也得到了快速发展。包括对黄曲霉毒素[20]、玉米烯酮[21]、赭曲霉毒素[22]和脱氧雪腐镰刀菌烯醇[23]等真菌毒素的检测。此外该技术也应用于食源性致病菌的检测。病原微生物引起的食源性食物中毒是影响我国食品安全问题的主要因素之一，对食源性致病菌的快速检测在食品安全领域具有积极重要作用。Jung[24]等利用双抗夹心法建立了胶体金免疫层析试纸条检测大肠杆菌O157的方法。其他食源性致病菌，如沙门氏菌[25]、金黄色葡萄球菌[26]、单增李斯特菌[27]、志贺氏菌[28]和副溶血性弧菌[29]等也通过免疫层析试纸条建立了相关的检测方法。4总结综上所述，层析技术在生物、医药及食品领域的应用越来越广泛，尤其是免疫层析技术在食品安全的快速检测所起的作用日趋重要。不过目前国内关于免疫层析技术方面的研究远落后于国外，更深入的研究还有很大的探索空间。故今后标记免疫层析技术的研究可从以下几个方面深入探索:1)研究开发稳定剂以提高标记物-抗体探针抗干扰能力,减少假阳性或假阴性现象的发生;2)探寻能与标记探针相容的生物信号放大物质,提高检测的灵敏度;3)制备特异性好的类生物抗体或改进标记技术以提高标记免疫层析方法的检测通量,降低检测成本;4)研究标记物的制备方法、探索标记抗体探针与目标物的识别机理,为拓宽标记免疫层析技术的检测范围奠定基础;5)研究其他标记免疫层析技术以补充食品安全检测方法。5参考文献[1]SalehMl，PokFW.SeParationofPrimaryandsecondaryaminesastheirsulfonamidederivativesbyreversed-phasehigh-Performanceliquidchromatography[J].J.Cheomatogr，A，1997，763:173一178[2]孟宪超，柳楠.层析技术在生物制药中的应用[J],科技论坛，2015：53.[3]杜雪岭.天然产物分离纯化过程中层析技术的研究—应用及相关过程模型化[D].北京，北京化工大学，2009：2-18.[4]JonesK.Areviewofbiotechnologyandlarge-scaleaffinityChromatography.Chromatographia,1991,32:469480.[5]YipTT,HutchensTW.Immobilizedmetalionaffinitychromatography.MolBiotechnol,1994,1:151164.[6]AsenjoJA.DownstreamProcessinginBiotechnology.NewYork:MarcelDekker,1991.1158.[7]Li,J.,Wang.,Wang,J.,etal.BothcorepressorproteinsSMRTandN-CoRexistinlargeproteincomplexescontainingHDAC3[J].TheEMBOJournal,2000,19(16):4342-4350.[8]Rodrigues,M.L,Travassos,L.R