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层析聚焦技术读书笔记层析聚焦（chromatofocusing）是Sluyterman等在等电聚焦技术的基础上首先建立的一种高分辨的新型的蛋白质分离纯化技术。层析聚焦原理包括pH梯度溶液的形成、蛋白质的层析聚焦行为和聚焦效应。层析聚焦是利用例子交换剂本身的带电基团的缓冲作用，当洗脱缓冲液滴到离子交换柱上时，自动形成pH梯度。当层析介质的pH低于它的等电点时，蛋白质带正电荷，它不与阴离子交换剂结合，随洗脱液向下移动，然而，在蛋白质从柱顶向下移的过程中，其周围pH逐渐增高，当它移动到某一点，其环境的pH高于蛋白质等电点时，蛋白质由正电荷变为负电荷，而与离子交换剂结合。随着洗脱过程进行，所形成的pH梯度也不断下移，当pH下降至蛋白质的等电点时，蛋白质又重新脱离交换剂而下降，移至pH大于等电点时又重新结合，这样不断重复，直至蛋白质从柱下流出。不同的蛋白质有不同的等电点，在它们被离子交换剂结合以前将移动不同的距离，按等电点顺序流出从而达到了分离的目的。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫聚焦效应。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速率进行吸附、解吸附，直到pHpI时被洗出，若在此蛋白质样品被洗出前，再加入第二份同种蛋白质样品时，后者将在洗脱液的作用下快速向前移动，而不被固定性吸附，直到其迁移至近似本身等电点处（即第一个样品的缓慢迁移处）。然后两份样品以同样的速率迁移，最后同时从柱底洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入尚未洗出，并且有一定的聚焦时间，就还可将样品再加到柱上。层析聚焦技术的仪器设备：层析检测装置、泵、紫外检测仪、pH计、记录仪、部分收集器层析聚焦技术操作步骤：（1）多缓冲剂的选择（2）多缓冲交换用量的选择（3）多缓冲交换的预处理与装柱（4）样品的装备（5）上样与洗脱（6）从分离的蛋白质中去除多缓冲剂的方法（7）多缓冲离子交换剂的再生处理为了提高分辨率，选择的实验pH范围应包含要分离样品各组分等电点，并使其有2/3~1/2柱长的吸附解析时间。装柱之前，凝胶必须用起始缓冲液平衡。样品体积最好不超过0.5个床体积，样品不能含过量盐。要得到较好的洗脱峰，洗脱流速一般控制在30~40cm/h。层析聚焦技术的影响因素：1、选定的吸附剂2、选定的溶剂极性3、相对于需待分离的物料量的柱子尺寸（长度和直径）4、洗脱或流动的速率层析聚焦技术的应用：1、分离模型蛋白质2、分离复杂物质3、鉴定某些酶的性质（可用作测定蛋白质等电点的一种方法）层析聚焦过程示意图测定样品的等电点选择适当的多缓冲剂和多缓冲交换剂用起始缓冲液平衡的交换剂装入柱中让5~10ml多缓冲剂流过柱体加样用起始缓冲液重新平衡用多缓冲液洗脱需要的样品调节多缓冲剂pH到梯度下限层析柱再生洗脱液被分离、分析所需装置紫外检测仪pH仪记录仪部分收集器泵调节起始缓冲液至梯度的上限