纳米检测技术在食品安全中的应用

纳米检测技术在食品安全中的应用theapplicationofnanotechnologyinfoodsafety邓国哲农产品加工及贮藏工程09级1.纳米及纳米技术介绍2.纳米技术的发展历程3.纳米检测技术的原理4.纳米检测技术的分类及应用5.纳米检测技术的发展前景主要内容纳米（又称毫微米）是一种长度单位，即10亿分之一米，约相当于4至5个原子串起来那么长；1纳米=百万分之一毫米，是十个氢原子并排起来的长度；1000纳米=1微米；10纳米相当于一根头发丝宽度的1/1000；纳米技术纳米科学与技术，有时简称为纳米技术，是研究结构尺寸在0.1至100纳米范围内材料的性质和应用。它的最终目标是直接以原子或分子来构造具有特定功能的产品。纳米材料的特性1.表面与界面效应一般材料的晶体粒表面原子数与总原子数之比会随粒径变小而急剧增大，引起一系列性质上的变化。如金属纳米粒子在空中会燃烧，无机纳米粒子会吸附气体等等。2.小尺寸效应当纳米微粒尺寸与光波波长、德布罗意波长等物理特征尺寸相当或更小时，它的周期性边界被破坏，从而使其声、光、电、磁、热力学等性能呈现出“新奇”的现象。例如，铜颗粒达到纳米尺寸时就变得不能导电；绝缘的二氧化硅颗粒在20nm时却开始导电。当黄金被细分到小于光波波长的尺寸时，就会失去原有富贵光泽而成黑色。3.量子尺寸效应当粒子的尺寸达到纳米量级时，费米能级附近的电子能级由连续态分裂成分立能级。当能级间距大于热能、磁能、静电能、光子能或超导态的凝聚能时，会出现纳米材料的量子效应，从而使其磁光声热电超导等性能变化。纳米粒子的制备方法1.物理方法1.1真空冷凝法用真空蒸发、加热、高频感应等方法使原料气化或形成等离子体，然后骤冷。其特点是纯度高、结晶组织好、粒度可控，但技术设备要求高。1.2爆炸法通过电火花爆炸等方法得到纳米粒子。其特点操作简单、成本低，但产品纯度低，颗粒分布不均匀。1.3机械球磨法采用球磨方法，控制适当的条件得到纯元素纳米粒子、合金纳米粒子或复合材料的纳米粒子。其特点操作简单、成本低，但产品纯度低，颗粒分布不均匀。2.化学方法2.1气相沉积法利用金属化合物蒸气的化学反应合成纳米材料。其特点是产品纯度高，粒度分布窄。2.2溶胶—凝胶法从金属的有机化合物或无机物的溶液出发，在低温下通过水解、聚合等化学反应，首先生成溶胶进而形成具有一定空间结构的凝胶，然后经过适当热处理或减压干燥，制备出相应的粉末、薄膜和本体材料。纳米材料与食品检测1.纳米材料是非常敏感的化学和生物传感器，与生物学、电子材料相结合，可以制备新型的传感器件。2.所有用于生物传感的纳米材料或器件的结构都有两个特点：第一，它们含有针对分析物的特定的识别机制，比如抗体或酶；第二，它们可以从分析物中产生独特的标志信号，并且这种标志信号可以由纳米结构自身产生或者由纳米结构固定的分子或含有的分子产生。纳米金检测技术的原理纳米检测技术现在已经应用到各个领域，在食品安全中的应用的主要是纳米金免疫标记技术；纳米金即金的微小颗粒，其直径在1~100nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性；由于金颗粒具有高电子密度的特性，显微镜下观察金标蛋白结合处可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而可应用于定性或半定量的快速免疫检测中。胶体金的特性1.呈色性胶体金的光散射性随溶胶颗粒的大小产生肉眼可见的显著变化，如小颗粒在2~5nm为橙黄色，中等大小的颗粒在10~20nm为酒红色，大颗粒在30~80nm为紫红色。2.光吸收性胶体金有单一吸收峰，在510~550nm之间，随颗粒变大而偏向长波长，利用此特性可用吸光度检测。胶体金溶胶中金粒子的双电子层结构Structureofdoubleelectrodelayerofnanogoldcolloids通过氯金酸还原法可以制得不同粒径的纳米金颗粒纳米金免疫标记技术的特点：1.快速.2.准确.3.灵敏.4.特异性强.胶体金免疫层析技术该技术的基本原理是将异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上。当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细管作用向前移动，遇到结合垫上的胶体金标记试剂，反应后再移动到固定的抗原或抗体区域时，待测物和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上。而游离标记物侧越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。胶体金免疫层析原理酶联免疫吸附法（ELISA）1.双抗体夹心法：测定待测标本中是否含有抗原。2.间接免疫吸附测定法：检测血清中是否含有特定抗体。免疫金标记试纸条免疫金标记试纸条的原理都是基于酶联免疫反应：免疫金标记试纸条的应用实例轮状病毒试剂盒，通过免疫金法定性检测人类粪便标本中轮装病毒抗原。HIV（1+2）抗体检测试纸检测原理试纸条检测结果纳米技术与生物传感器纳米技术的介入为生物传感器提供了无限想象的空间。纳米颗粒(如纳米金、磁粒子、荧光颗粒等)可以广泛地应用于敏感分子的固定、信号的检测和放大以及待测物质的富集和浓缩。纳米材料由于其独特的理化特性，能显著地提高生物传感器检测的灵敏度，缩短检测时间的同时提高了检测通量。纳米芯片微尺度1.声波生物传感器声波生物传感器是检测待检物质引起声波频率改变的传感器。以石英晶体微天平生物传感器为例，在压电晶体的两面采用离子束沉积等方法形成两个平行金属膜电极，膜电极的表面固定识别分子，识别分子特异性的结合待检测分子，引起电极表面的质量变化，从而改变石英晶体的振荡频率。如用纳米胶标记抗体，通过抗原抗体反应将其结合到石英晶体表面，这样就提高了标记分子的质量，石英晶体的振荡频率也随之提高，检测信号被放大，相应地检测灵敏度也就提高了。2.光学生物传感器纳米颗粒可以用于光共振检测：1.通过抗原-抗体或蛋白-受体结合等方法在导电材料表面固定纳米金属颗粒团；2.纳米粒子引起反射光的共振增强，通过检测共振信号即可探知待检测物质；3.纳米颗粒也可以用来定位肿瘤，荧光素标记的识别因子与肿瘤受体结合，然后在体外用仪器显示出肿瘤的大小和位置。纳米颗粒用于实时荧光检测：1.纳米金属颗粒作为一种通用的荧光泯灭基团；2.在寡核苷酸探针分子的两端分别标记纳米金颗粒和荧光激发基团，探针由于碱基互补形成“发卡”结构，荧光激发基团和纳米金颗粒靠近，引起激发荧光湮灭；3.当探针与特异性靶DNA结合后，其构象发生变化，纳米金颗粒和荧光激发基团分离，从而激发出荧光。4.该原理可用于核酸的实时荧光检测，以及单碱基突变多态性检测等。3.磁性生物传感器通过磁性纳米材料标记生物分子，结合分子识别技术，可以在磁场梯度下实现样品的混合、分离、检测等复杂操作。Chemla等人利用顺磁性的纳米颗粒和基于高温瞬态直流超导量子界面装置(superconductingQUANTUMinterferencedevice，SQUID)的显微镜，提出了一种新颖的生物样品的快速检测技术。该方法如下：1.把固定抗体的磁性颗粒悬浮在溶液中。2.瞬时磁场脉冲下产生磁化纳米颗粒，磁场消失时，颗粒趋向自由分布。没有结合抗体的颗粒呈布朗运动而无检测信号。3.结合靶分子的纳米颗粒按照Neel松弛方式运动，产生一个缓慢衰减的磁信号，通过SQUID采集的信号即可检出待测物质。4.无需分离未结合待测分子的纳米颗粒而直接检测标记分子，缩短了检测时间，提高了效率。4.电化学生物传感器纳米粒子具有极佳的比表面积，用于生物分子的固定能增加固定分子的数量，从而实现信号的放大。在硅纳米颗粒表面固定乙酰胆碱脂酶，可用于制造有机磷农药生物传感器，由于具有较高的比表面积，响应迅速，灵敏度高，对杀虫剂的检测下限可达10-6mol/l。把胶体金纳米颗粒固定在胱氨酸修饰的金电极表面，增加了ssDNA探针的固定效率，提高了检测的灵敏度。5.免标记生物传感器对单晶硅进行电化学腐蚀可得到具有纳米孔径的多晶硅，该材料在室温下可发射可见光；多晶硅的高比表面积增加了可固定的敏感分子数量；与现有硅加工技术相容有利于其各种形式的微加工和大规模生产；在多晶硅的表面固定寡核苷酸、生物素或者抗体等识别分子，通过检测光干涉和折射率的变化可构建一种新型的免标记的生物传感器，可用于cDNA的检测；硅材料纳米生物传感器二氧化硅纳米丝自行组成的精美图案6.光纤纳米免疫生物传感器该技术融合了光学和光子学，利用抗原抗体能特异性结合的性质，将感受到抗原或抗体量转换成光学信号的一类传感器；由于该传感器在敏感部件上使用了纳米产品，因此能用于单个细胞的测量；Dinh等人研制出了一种用于检测BPT（BenzoPyrenetetrol）的光纤免疫生物传感器；该传感器制作方法如下：首先用光纤拉制仪制作直径10nm~100nm的石英光纤；光纤头部硅烷化，并用BPT的抗体修饰光纤头部，随后将光纤其余部分镀银以防止光露出；在单细胞操作的显微操纵仪/显微注射器上进行细胞穿刺及检测实验；光电倍增管PMT记录BPT与抗体结合后产生的荧光，通过测定荧光强度的变化检测细胞内BPT的含量；纳米技术与基因芯片2002年Park等在《Science》上介绍了一种以纳米金为探针的基于电荷检测的新型基因芯片，该芯片具有非常好的灵敏度和特异性，可在十万分之一比率中检测出单碱基突变的基因片段。以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片目前通用的基因芯片技术多采用荧光素或同位素为信号报告分子，存在或灵敏度不高、操作复杂或需要特殊检测设备、易污染等缺点，从而限制了该技术在临床、环境、食品检测中的应用。采用纳米金作为信号报告分子，利用其与银反应相结合可使信号放大106的优势，从而将杂交结果信号进行足够的放大，形成裸眼可见的颜色信号。这样既提高了检测的灵敏度，又克服了现有技术的不足。1.基因芯片的制备按下图制作芯片：每个探针4个平行点2.芯片的银染放大反应滴加60μL银染试剂于上芯片上杂交反应区，盖上盖玻片使银染试剂均匀分布，37℃反应30min后用去离子水冲洗玻片；晾干芯片后重复上述步骤继续染色，直至最佳显色效果。可直接裸眼判定检测结果或扫描仪扫描后进行灰度值计算。2.1银染放大反应的优化采用短时间多次显色可避免由于银离子的自身聚集而干扰显色的结果。3.芯片检测敏感性试验以金黄色葡萄球菌为试验对象，杂交液中加入纳米金标记待检样品的终浓度分别为50pM、10pM、5pM、1pM、500fM、100fM、50fM、10fM、1fM、0.5fM，分别在芯片上各小室内进行杂交。3.1敏感性检测结果可以看出，在裸眼观察条件下，该芯片的最低检测限值为100fM.固相萃取-HPLC联用技术近几年固相萃取技术在样品前处理中得到广泛的应用，由于该方法具有简单、灵敏度高、可以排除复杂样品中基质的干扰等特点，已成为兽药残留分析前处理的首选。与HPLC联用可以克服HPLC检出限高的缺点，发挥其高分辨率、高灵敏度的特点。纳米检测技术的发展前景由于纳米材料的界面效应、小尺寸效应及量子尺寸效应，使其具有很多独特的性质。与常规检测技术相结合，可以提高检测的灵敏度、实现大通量检测，更可以实现现场检测、省时省力，是未来检测技术的发展方向。纳米技术的展望纳米技术和生命科学是21世纪最前沿的两大学科，纳米技术的介入为生物传感器的发展提供了无限想象的空间。纳米生物传感器灵敏度高、成本低、一次性使用等的优点使其广泛应用于食品环境战场人体疾病等领域的快速检测