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第38讲微生物的培养与应用[最新考纲]1.微生物的分离和培养。2.培养基对微生物的选择作用。3.某种微生物数量的测定。4.微生物在其他方面的应用。考点一微生物的实验室培养1.培养基(1)概念：人们按照微生物对的不同需求，配制出供其的营养基质。(2)营养组成：一般都含有和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对、氧气以及的要求。(3)种类：按照物理性质可分为培养基和固体培养基。营养物质生长繁殖水、碳源、氮源pH特殊营养物质液体2.无菌技术(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止的方法。(2)关键：防止的入侵。(3)不同对象的无菌操作方法(连线)杂菌污染外来杂菌3.大肠杆菌的纯化培养(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基①操作步骤②倒平板的方法及注意事项称量灭菌倒平板a.请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：。b.甲、乙、丙中的灭菌方法是。c.丁中的操作需要等待才能进行。(2)纯化大肠杆菌的方法①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到__________________的肉眼可见的，即可获得较纯的菌种。②纯化大肠杆菌的关键步骤：。③常用的微生物接种方法有两种a.平板划线法：是通过在琼脂固体培养基表面__________的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。丙→乙→甲→丁灼烧灭菌平板冷却凝固由一个细胞繁殖而来菌落接种接种环连续划线b.法：是将菌液进行一系列的，然后将的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。(3)菌种的保存方法①对于频繁使用的菌种，可以采用的方法。②对于需要长期保存的菌种，可以采用的方法。稀释涂布平板梯度稀释不同稀释度临时保藏甘油管藏1.(教材P16旁栏思考题解答)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。①培养细菌用的培养基与培养皿②玻棒、试管、烧瓶和吸管③实验操作者的双手提示①、②需要灭菌；③需要消毒。①为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？提示通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。②平板冷凝后，为什么要将平板倒置？提示平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。2.(教材P17“倒平板操作讨论”解答)3.下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请思考：(1)图甲是利用________法进行微生物接种，图乙是利用________法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________和酒精消毒。(2)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？______________________________________________________。(3)下图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填“图甲”或“图乙”)。提示(1)平板划线稀释涂布平板接种环涂布器灼烧灭菌(2)火焰附近存在着无菌区域(3)图乙1.(2016·全国课标卷Ⅰ，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：①配置培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；②制作无菌平板；③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。(2)步骤③中，实验组的操作是_______________________________________________________________________________。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。解析(1)牛肉膏和蛋白胨都含有蛋白质的水解产物，都可以作为氮源；平板为固体培养基，故需要加入凝固剂琼脂。(2)实验探究的是教室内“不同高度空气”中微生物的分布，其中变量为不同高度，故需在不同高度下放置开盖平板。同时，为了保证单一变量，需要保证开盖放置时间一致。为了保证实验可靠性，需要设置多个平行组。(3)在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落。若出现菌落，表明操作过程中存在杂菌污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用。答案(1)牛肉膏、蛋白胨琼脂(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(3)污染不正确2.(2016·深圳六校联盟模拟)人们使用含三丁基锡、三苯基锡等有机锡化合物的油漆涂于船只、海洋建筑物等的表面，有效防止了海洋生物附着生长，但近年来的研究发现油漆中的有机锡可释放入海，对多种生物造成毒害。现欲从海洋底泥中分离分解三丁基锡的微生物。回答下列问题：(1)为了获得能降解三丁基锡的微生物菌种，可在被三丁基锡污染的海洋底泥中取样，并应选用以为碳源的培养基进行选择培养。除含有碳源外，培养基还应含有________、________、________、无机盐和蒸馏水等。(2)实验过程中，玻璃器皿和金属用具可以采用干热灭菌法来灭菌，原因是_________________________________。(3)常用的微生物接种方法有两种，但只有________________可用于微生物的计数，运用该方法计数的结果往往比实际数目________(填“高”或“低”)。在平板划线操作中，接种环在使用前要先灼烧，其目的是____________________，第二次及其后的划线都要从上一次划线的末端开始，其目的是____________。(4)将获得的3种待选微生物甲、乙、丙分别接种在含少量三丁基锡的相同培养液中培养(培养液中其他营养物质充裕、条件适宜)，观测从实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为33小时、15小时、46小时，则应选择微生物________作为菌种进行后续培养。答案(1)三丁基锡氮源琼脂(2)玻璃器皿和金属用具能耐高温，且要保持干燥(3)稀释涂布平板法低杀灭接种环上的微生物使微生物数目能够随着划线次数的增加而逐步减少，以达到分离的效果(4)乙3.工厂的污水池含有一种有害的、难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如下图所示。请分析回答下列问题。(1)加入化合物A的培养基属于________培养基。化合物A可为目的菌提供生长所需的________等营养物质。若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是____________________________________________________。(2)微生物培养过程中，防止杂菌污染的关键技术是________，为了排除杂菌污染如何设计对照实验____________________________________________________________________________。(3)在农业生产研究中，常需要进行微生物的培养和计数。下图是利用平板划线法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，为达到这一目的，操作上有很多注意事项。请列举两项。答案(1)选择碳源和氮源稀释涂布平板法(2)无菌技术用不接种的空白培养基作对照，证明培养基制备是否被杂菌污染(3)①每次划线前要灼烧接种环②冷却后从上一区划线末端开始划③首尾区不重叠(任选两个答案)1.无菌技术条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属用具高压蒸汽灭菌法培养基及容器2.两种纯化细菌的方法的比较项目优点缺点适用范围平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延适用于厌氧菌和兼性厌氧菌考点二微生物的筛选和计数1.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数项目详细内容实验原理(1)能合成________的细菌才能分解尿素(2)配制以________为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌数量统计(1)_________法(显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板)(2)间接计数法：________________实验流程土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→________→涂布平板与培养→菌落________脲酶尿素直接计数稀释涂布平板法系列稀释计数2.分解纤维素的微生物的分离(1)纤维素酶①组成：纤维素酶是一种，一般认为它至少包括三种组分，即。②作用复合酶C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶纤维二糖葡萄糖(2)纤维素分解菌的筛选①原理②筛选方法：染色法，即通过是否产生来筛选纤维素分解菌。③培养基：以为唯一碳源的选择培养基。红色复合物透明圈刚果红透明圈纤维素④实验流程纤维素选择培养基梯度稀释鉴别纤维素分解菌透明圈(3)分离纤维素分解菌所用的两种培养基比较分离纤维素分解菌的实验中先用培养基，再用培养基。①选择培养基为培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。②鉴别培养基含琼脂，为培养基，细菌可在培养基上形成肉眼可见的菌落。刚果红染色法应用的就是鉴别培养基。选择鉴别液体固体3.结果分析与评价内容现象结论有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染培养物中菌落数偏高被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入其他氮源选择培养基的筛选作用牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基具筛选作用样品的稀释操作得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近1.(2016·四川卷，10)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白质含________个氨基酸。解析(1)脲酶能够催化尿素分解为氨，故图中选择培养基应以尿素作为唯一氮源。由于尿素被分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，使酚红指示剂变红色。(2)用于计数细菌菌落数的接种方法是稀释涂布平板法，统计的菌落数应介于30～300之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数，每克土壤样品中的细菌数量为(156＋178＋191)/3÷0.1×105＝1.75×108。由于两个或多个细菌连接在一起时，往往统计的是一个菌落，故用此方法测得的细菌数偏少。(3)密码子由三个相邻的碱基组成，271个碱基和后面2个碱基一起共构成91个密码子，插入的70个核苷酸和后面2个碱